SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

河南华溪蟹金属硫蛋白原核表达载体的构建

[目的]构建河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）金属硫蛋白（MT）的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。     

人源弹性蛋白酶基因原核载体构建及表达

从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中.然后用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B.将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上.用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD.经包涵体复性后在弹性蛋白酶活性检测平板上发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生,可初步证实表达产物具有生物活性.     

口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建

根据si RNA设计原则,分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点,设计了2个si RNAs,并将si RNAs克隆到p SIREN-Shuttle中,获得2个si RNA重组表达载体p Shuttle-L和p Shuttle-2B。用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切si RNA重组表达载体和腺病毒质粒载体p Adeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组腺病毒质粒p Adeno-L和p Adeno-2B。     

基于密码子优化策略的牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的原核表达及纯化

为了构建pET30a-bPAG9重组表达载体,并在BL21(DE3)感受态细胞中转染高效表达牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9),通过生物信息学技术对bPAG9基因进行密码子优化,人工合成bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体pET30a中。将构建的重组质粒pET30a-bPAG9转染至BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和亲和层析方法获得重组蛋白bPAG9。用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白bPAG9的表达效果。结果显示,PCR扩增得到1 128 bp的优化bPAG9基因片段,构建的重组质粒pET30a-bPAG9经双酶切获得约5 244 bp和1 125 bp的2条片段,与预期值相符;对重组载体测序,测序结果与优化后的基因碱基序列完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得相对分子质量约为4.0×10~4的bPAG9重组蛋白,通过亲和层析纯化后,重组蛋白bPAG9纯度到达90%以上。     

MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5''端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏茵鞭毛蛋白FIiC的原核表达及纯化

对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC的基因进行克隆、鉴定和原核表达,为鞭毛蛋白佐剂作用的研究奠定基础。以鼠伤寒沙门氏菌8014菌株基因组DNA为模板,PCR扩增Flic基因,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pQE30（＋）连接构建重组表达质粒Flic—pQE30,将此重组质粒转化人表达宿主E．coliXLI—Blue菌株内抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以1PTG进行诱导后,表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS—PAGE和Westernblot分析。测序结果显示,FliC为完整的编码区基因1485bp,编码495个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为56kDa。经SDS—PAGE分析表明,以37℃、1mM的IPTG诱导5h,表达效果最好,诱导产物是与理论值相符的56kDa的融合蛋白。经western—blotting检测,表达的重组蛋白FliC可与小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。成功进行了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白nic基因的克隆表达,为进一步研究其免疫佐剂作用奠定了基础。     

蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。     

Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因重组表达质粒的构建。利用来自重组质粒pLmleA的，mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件。以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS—PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中。获得的转化子在添加了L-苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L-苹果酸及L-乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L-苹果酸转化成L-乳酸，L-苹果酸和L-乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，L-乳酸的生成量为1002—1106mg／L。苹果酸的相对降低率为19．16—22．34％。     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

小菜蛾阿维菌素和虫酰肼抗性品系对几种新型药剂的交互抗性研究

以敏感品系为对照,利用室内筛选获得的虫酰肼和阿维菌素高抗品系Teb-R和Aba-R,测定了小菜蛾对几种新型杀虫剂的交互抗性。结果发现:小菜蛾对虫酰肼产生高水平抗性后(抗性倍数185.5倍),对阿维菌素表现出中等水平交互抗性(41.0倍),对茚虫威(11.4倍)和溴虫腈(5.3倍)仅表现出低水平交互抗性,对多杀菌素(1.7倍)和氯虫苯甲酰胺(1.4倍)则没有表现出明显的交互抗性。用阿维菌素筛选Teb-R品系39代后获得阿维菌素高抗品系Aba-R(593.8倍),该品系对茚虫威(12.3倍)表现出中等水平交互抗性,对多杀菌素(7.9倍)表现出低水平交互抗性,对溴虫腈(2.7倍)和氯虫苯甲酰胺(0.9倍)的交互抗性不明显;同时该品系对虫酰肼的抗性也由阿维菌素筛选前的185.5倍下降到筛选后的28.0倍,也没有交互抗性。基于上述研究结果认为,使用虫酰肼防治小菜蛾出现抗性后,可以使用多杀菌素和氯虫苯甲酰胺进行替代防治,但不宜用阿维菌素、茚虫威和溴虫腈进行替代防治;利用阿维菌素防治小菜蛾产生抗性后,可以用溴虫腈、氯虫苯甲酰胺和虫酰肼进行替代防治,但不宜用多杀菌素和茚虫威。     

Water quality,agriculture and food safety in China:Current situation,trends, interdependencies,and management

Water quality in China is becoming a severe challenge for agriculture and food safety,and it might also impact health of population via agriculture and food. Thus,it is causing widespread concern. Based on extensive literatures review and data mining,current situation of water pollution in China and its effects on food safety were analyzed. The 2nd National Water Resource Survey in China show that the surface water all over the country was under slight pollution and about 60% of groundwater is polluted. Drinking water quality is basically guaranteed in urban area but it is worrisome in rural areas. In addition,China is the largest consumer of fertilizer and pestici de in the world and the amounts of application still show increasing trends. Fertilizers and pesticides are the most important sources of pollution,which affect human health as persistent organic pollutants and environmental endocrine disruptors. Eutrophication of surface water and nitrate pollution of groundwater are serious threats to drinking water safety. Sewage irrigation is becoming a pollution source to China's water and land because of lacking of effective regulations. Although,with the advance in technology and management level,control of nitrogen and phosphorus emissions and reducing water pollution is still a major challenge for China.     

拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型,分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点,比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点;以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针,明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置,测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数;通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上,在小麦的B组染色体上仅有零星分布,在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上,在小麦的A、D组染色体中分布较少,但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点,可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似,而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大,甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列,不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析,可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体,并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。     

断根与打顶对番茄嫁接愈合的抑制作用

【目的】断根嫁接苗和打顶双干或多干嫁接苗日益广泛用于番茄栽培,丰产作用显著。了解断根与打顶对番茄嫁接愈合的作用机制,可为番茄嫁接生产提供理论依据。【方法】以‘硬粉8号’为接穗品种,‘砧爱1号’为砧木品种,观测断根和打顶后番茄嫁接愈合进程、成活率和木质部连通性等,同时测定嫁接接合部生长素和细胞分裂素的含量及愈合相关基因的表达。【结果】断根和打顶抑制了嫁接接合部上方木质部分化基因VND7的表达,并显著延迟了木质部的重构。断根显著降低了嫁接后12和72 h接合部玉米素核苷（tZR）和反式玉米素（tZ）的含量,以及嫁接后12 h接合部吲哚-3-乙酸（IAA）,吲哚-3-乙酸甲酯（ME-IAA）和吲哚-3-甲醛（ICAld）的含量;打顶嫁接后12 h接合部IAA和ME-IAA含量显著低于对照和断根处理,下调了嫁接后3和12 h接合部上方和下方韧皮部分化相关基因NEN4表达水平。断根或打顶均下调了嫁接后3—48 h接合部上方细胞分裂相关基因Histone H4和SlcycB1-4的表达水平;断根和打顶同时处理使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量显著低于断根处理,使tZR和tZ的含量及木质部连通性显著低于打顶处理。打顶和断根后分别在嫁接接合部施用10 mmol∙L^-1 IAA和10 mmol∙L^-1 6-BA可显著促进嫁接苗木质部的重构。【结论】断根和打顶分别降低接合部细胞分裂素和生长素积累,下调愈合相关基因表达,降低木质部输导能力,进而延缓番茄嫁接愈合进程。     

芦荟多糖抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用试验

在安全浓度的基础上,将芦荟多糖稀释成不同浓度,作用于猪繁殖与呼吸综合征病毒,当病毒对照CPE达到70%～80%后,在酶联免疫检测仪上测定A490nm值,A490nm值越大,表明细胞生长越旺盛,抗感染效果越好。在先加芦荟多糖后接种病毒时,多糖对PRRSV感染有阻断作用,且作用显著;在加芦荟多糖之前先接种病毒,则芦荟多糖对PRRSV的抑制作用不明显;高浓度芦荟多糖对PRRSV具有直接杀灭作用。     

氮素用量对结球甘蓝生长及产量和品质的影响

研究了氮素用量对结球甘蓝生长及产量、品质的影响.结果表明,随着施氮量的增加,结球甘蓝生长势增加,产量增加,但氮素用量过多会导致产量下降.本试验条件下,施氮量为0.6 t/hm2时结球甘蓝产量较高,达85.9 t/hm2,而施氮量为1.05 t/hm2时结球甘蓝产量仅为70.3 t/hm2,前者比后者增产22%,但二者分别比CK增产174.9%、125%.此外,增施氮素可降低结球甘蓝干物质、纤维素、有机酸及可溶性糖含量,还显著提高了硝酸盐含量.