微波提取大青叶中4（3H）喹唑酮的工艺研究

目的：优选大青叶中有效成分4（3H）喹唑酮微波提取法的最佳工艺条件。方法：以4（3H）喹唑酮舍量为指标,采用正交试验考察药材粒度（A）、提取溶剂浓度（B）、微波辐射时间（C）、溶剂倍量（D）4个因素时微波提取法结果的影响。结果：微波提取的最佳工艺条件为A282C1D1,即40目的药材粒度,用10倍量的50％乙醇微波辐射10min。结论：微波提取法具有提取率高、提取速度快、能量消耗小等优点。     

欧亚类禽H1N1与古典H1N1亚型猪流感病毒NA基因遗传进化分析

本研究对2011年分离自吉林省猪群的3株流感病毒进行了遗传进化分析。结果表明欧亚类禽H1N1猪流感病毒和古典H1N1猪流感病毒在吉林省猪群中共同流行,因此加强猪流感流行病学调查具有重要意义。     

欧亚类禽H1N1与古典H1N1亚型猪流感病毒NA基因遗传进化分析

本研究对2011年分离自吉林省猪群的3株流感病毒进行了遗传进化分析。结果表明欧亚类禽H1N1猪流感病毒和古典H1N1猪流感病毒在吉林省猪群中共同流行,因此加强猪流感流行病学调查具有重要意义。     

辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析

本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA—HI试验和RT—PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A／swine/Liaoning／01／2012（H1N1）,通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果表明,分离株HA基因裂解位点附近的氨基酸序列为IPSIQSRjG,符合低致病力流感病毒的分子特征。全基因组进化树结果表明,分离株的8个基因片段与A／swine／Jiangsu／40／2011（H1N1）株核苷酸同源性最高,分离株处在类禽型H1N1亚型遗传进化分支上;由于类禽型H1N1猪流感病毒具有潜在感染人的潜力,在国外和国内均有感染人的报道,因此,辽宁省首次分离到该型猪流感病毒对全省养猪业和公共卫生安全具有重要意义,值得深入研究。     

清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的研究

以MDCK细胞为H1N1亚型流感病毒宿主,金刚烷胺为阳性对照药物,通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝比色法(MTT)测定清毒片对病毒的3种不同作用方式,即先感染病毒后给药,先给药后感染病毒和药物病毒同时作用,每种方式3个重复,观察清毒片对H1N1亚型流感病毒的抑制作用。结果表明,中药清毒片具有不同形式的抗H1N1亚型流感病毒作用,抑制病毒在细胞内合成作用,阻止病毒吸附传入细胞作用和直接灭活病毒作用。清毒片抑制H1N1亚型流感病毒在细胞内合成作用的3个重复的半数有效浓度(EC50)分别为411、434、532μg/mL,治疗指数(TI)为3.5;清毒片阻止H1N1亚型流感病毒的吸附、传入细胞的3个重复的EC50分别为404、458、467μg/mL,TI为3.6;清毒片对H1N1亚型流感病毒直接灭活作用的3个重复的EC50分别为479、481、461μg/mL,TI为3.4。说明清毒片体外对H1N1亚型流感病毒株具有明显的抑制作用,为H1N1亚型流感病毒感染的治疗和临床用药提供了理论依据。     

甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒检测基因芯片的制备与初步应用

建立DNA微列阵技术检测甲型H1N1和季节性H1N1流感病毒的方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。通过生物医学数据库甲型H1N1流感病毒及季节性H1N1亚型流感HA与NA基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证。试验所设计的探针可以对甲型H1N1流感与季节性H1N1流感病毒进行区分,用该方法检测了长春市CDC送检的6份疑似甲型H1N1流感病毒临床病例,4份阳性,检测结果同实时荧光定量PCR方法一致。结果表明,利用本研究建立的DNA微列阵技术检测甲型H1N1流感病毒方法,特异性和敏感性强,可作为甲型H1N1流感病毒临床标本检测方法。     

抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础.     

甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。     

我国猪群H1N1亚型流感病毒流行情况与生物学特性

感染猪群的流感病毒（swine influenza virus,SIV）对养猪业和公共卫生均构成一定威胁。对H1N1亚型SIV监测发现,经典猪H1N1(classical swine H1N1,CS H1N1)、欧亚类禽H1N1(Eurasian avian-like H1N1,EA H1N1)、人源H1N1和2009年大流行H1N1(2009 pandemic H1N1,pdm/09 H1N1)亚型流感病毒均在我国猪群内传播,并且这些SIV相互间不断发生基因重组。一些H1N1亚型SIV会偶发性引起人类感染,对公共卫生存在潜在威胁。此外,H1N1亚型SIV还会引发犬和水貂等动物的感染。经动物模型试验发现,不同H1N1亚型SIV在小鼠、鸡、猪和雪貂中的致病性及传播能力不同,其中一些SIV分离株显示出致死性,需要对其进行生物学特征研究,评估其对人类的潜在风险。SIV导致的猪死亡率不高,因而对其关注较少。但是禽源和哺乳动物源流感病毒可以在猪体内重组为可引起人类大流行的流感病毒毒株,因此应该及时了解SIV的流行情况与生物学特性,并做好相应的控制措施,以减少经济损失,避免具有大流行潜力毒株出现。...     

甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用效果评价

为考核实验室检测甲型H1N1流感病毒的能力,设计和实施了“CNAS T0459甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证计划”.利用甲型H1N1流感病毒(2009)和经典H1N1猪流感病毒核酸标准物质制备6组能力验证阳性样品,经实验室检测分析,所制备的样品均匀性和稳定性均达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求.将6组阳性样品和1组阴性样品编号后下发54家参试实验室,共有50家实验室报送了有效数据,其中完全达到能力验证要求的实验室共34家,满意率达68％,其余16家为不满意实验室,包括8家实验室检测经典H1N1猪流感病毒满意,但甲型H1N1流感病毒(2009)特异性检测不满意.本次能力验证为整体提升我国甲型H1N1流感病毒的检测水平和评估各级实验室检测能力具有重要意义.     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

规模化驴场中马流感病毒H3N8亚型感染情况调查

[目的]调查山东省聊城市规模化驴场中马流感病毒的感染情况,并分析其可能的来源。[方法]从聊城的规模化驴场采集病料和血清,通过HI试验检测驴血清中的马流感病毒H3N8亚型抗体的阳性率。使用RT-PCR技术扩增肺脏和鼻腔棉拭子样品中的马流感病毒M基因,对获得的马流感病毒M基因与不同流感病毒的M基因进行序列比对,推测其来源。[结果]HI试验表明,120个血清样品中马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为33.3%(40/120);其中,母驴的马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为42.5%(17/40)、公驴为32.5%(13/40)、驴驹为25.0%(10/40)。通过RT-PCR检测发现,32.3%(21/65)的样品可测出目的条带。通过序列比对得出,该试验获得的流感病毒M基因与马属动物的H3N8亚型流感病毒高度同源(CY032222、CY032318、CY028821等),同源性最高可达99.8%。[结论]马流感病毒在聊城周边的数个规模化养驴场发生流行。该研究从驴体内分离的流感病毒M基因属于马流感病毒H3N8亚型M基因。     

马流感病毒A/Equine/Huabei/01/07(H3N8)对灵缇犬的实验性感染

为了解灵缇犬对马流感病毒A/Equine/Huabei/01/2007(H3N8)的易感性,将马流感病毒培养液以1.0 mL(含105.7EID50)经静脉途径接种4条灵缇犬,另以2.0 mL(含2×105.7EID50)经滴鼻、点眼方式接种3条灵缇犬。采用临床症状和病理学观察、免疫酶组织化学染色技术、病毒分离、HI抗体检测和流感病毒受体类型检测技术,对病毒在灵缇犬体内的感染情况进行了系统研究。结果表明,感染的7条犬在整个试验观察期间体温等临床指标均无异常变化,未见明显的肉眼和组织学病变。感染后5 d,4条感染犬的气管、支气管和细支气管上皮细胞内流感病毒M蛋白均为阳性,1条犬的咽拭子病毒分离结果为阳性,1条犬的马流感病毒H3亚型HI抗体阳性。感染后14d,剩余3条感染犬中有2条犬马流感病毒H3亚型HI抗体呈阳性。试验证明,目前流行的A/Equine/Huabei/01/2007(H3N8)病毒可以感染灵缇犬,但不导致灵缇犬出现明显的临床症状。灵缇犬的喉头、气管上皮细胞具有与马流感病毒结合的SAα2,3 Gal受体。     

福建省鸭禽流感病毒分离株（A/Duck/Fujian/FQ107/2007〔H9N2〕）全基因测序及遗传进化分析

为了解一株可引起产蛋鸭产蛋异常的H9N2亚型禽流感病毒A/Duck/Fujian/FQ107/2007（H9N2）（以下简称Dk/FQ107/07）分离株的分子特性及其遗传进化地位,运用RT-PCR方法对其基因组进行扩增,克隆至pMD18-T载体后测序。结果显示,Dk/FQ107/07病毒株的血凝素（haemagglutini,HA）蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PARSSR↓GLF-,其静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IVPI）为0.04,符合低致病性禽流感病毒特征;Dk/FQ107/07株HA基因与A/chicken/Shantou/5269/2005（H9N2）同源性最高,为98.9%,和我国首次哺乳动物流感病毒分离株A/Swine/HongKong/9/98（H9N2）有较近的遗传进化关系,三者均属于经典的H9N2/Y280群系;神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因与中国大陆首次分离株A/chicken/Beijing/1/1994（H9N2）相比,在63、64、65位点上缺失3个氨基酸（T、E、I）;核蛋白（nucleoprotein,NP）基因与高致病性鸭源禽流感分离株A/Duck/Fujian/1734/05（H5N1）和A/Duck/Fujian/9713/2005（H5N1）在同一遗传进化分支上,而从聚合酶（polymerase PA,PA）基因的遗传进化分析发现其基因属于H9N2/Y439群系。由此可见,Dk/FQ107/07可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物。     

中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒HA和NA基因的分子和遗传特征

目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素（haemagglutini,HA）基因和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）,以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。     

猪源流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。     

玉竹多糖和板蓝根多糖对环磷酰胺致雏鸡免疫抑制的调节作用研究

研究玉竹多糖和板蓝根多糖对环磷酰胺致雏鸡免疫抑制的调节作用。将120只1日龄雏鸡随机分成6组,分别为空白对照组、玉竹多糖对照组、玉竹多糖调节组、板蓝根多糖对照组、板蓝根多糖调节组、免疫抑制对照组,除空白对照组外,其余各组在7日龄时饮水免疫鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota株+H120株)。测定免疫后不同阶段雏鸡新城疫疫苗抗体滴度、血清IgA含量和外周淋巴细胞OD570 nm值,以及脾脏指数和法氏囊指数。结果显示,环磷酰胺造模后,可见环磷酰胺抑制对照组抗体滴度持续处于较低的状态,血清IgA含量较低,外周淋巴细胞增殖受抑制,免疫器官指数较低;在免疫后14 d、21 d、28 d和35 d,玉竹多糖调节组和板蓝根多糖调节组血清抗体滴度显著高于免疫抑制对照组(P<0.05);在免疫后21d、35 d,玉竹多糖调节组和板蓝根多糖调节组血清IgA含量、外周淋巴细胞OD570 nm值和免疫器官指数显著高于免疫抑制对照组(P<0.05)。本试验结果表明,玉竹多糖和板蓝根多糖对环磷酰胺造模形成免疫抑制雏鸡免疫系统具有调节功能,可解除免疫抑制,使免疫系统恢复至正常水平,能够提高雏鸡新城疫疫苗抗体滴度、血清IgA含量,增强外周淋巴细胞增殖。     

禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制

按照国家一级标准物质求,研制了一批禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家参考品,批号为200901。对其物理性状、无菌、效价、特异性、水分、真空度、均一性、稳定性等进行了测定,各项指标均符合求。经过8家单位对其协作标定,并经统计学分析,该批抗原血凝效价为1：（460±80）,最终定值为1：400。该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原可以作为国家参考品。