利用PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌

根据风信子黄腐病菌(Xanthomonas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA ,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌.用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术.用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测.结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险.     

进境风信子种球中菊基腐病菌的鉴定

从荷兰进境风信子种球带有典型软腐症状的样品上分离到1株细菌分离物5093-1,对该分离物进行菌落形态特征观察、致病性测定、过敏性反应测定、16S序列分析和Biolog测试。结果表明:该分离物人工接种风信子种苗、马铃薯薯块和蝴蝶兰均能引起腐烂反应,也能引起烟草过敏性坏死反应,16S序列和菊基腐病菌的序列相似性为99.6%,Biolog测试结果为菊基腐病菌。根据试验结果将分离物5093-1鉴定为菊基腐病菌。     

应用TaqMan MGB探针检测美澳型核果褐腐病菌

以美澳型核果褐腐病菌的6个菌株以及核果褐腐病菌一个和欧洲种仁果褐腐病菌这两种近似种为研究对象,通过对ITS区序列的比对分析,设计了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR引物和探针,建立了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法.设计了这3种近似种的通用引物和探针,用于检测过程中进行质量控制.     

双重PCR方法检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌

为建立同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法,根据GenBank上公布的洋葱腐烂病菌ITS序列设计1对特异性引物B3/B6,将设计的引物与已发表的检测菊基腐病菌特异性引物ADE1/ADE2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。应用双重PCR体系能从洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌基因组DNA以及人工带菌样品中扩增到特异性条带。结果表明,建立的双重PCR检测方法能同时检测出洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌,可应用于口岸进口郁金香种球2种检疫性细菌的检测。     

烟草三类根腐类病害病原真菌多重PCR检测方法的建立

本文分别设计和验证了烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的特异性检测引物,结合镰刀菌属通用引物,进行了烟草三类根腐类病致病菌-烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的多重PCR检测,并对影响多重PCR的退火温度、引物用量、d NTP用量、模板用量分别进行了分析。结果显示,退火温度在43?61℃范围内,烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的引物用量在0.2:0.32?0.48:0.2μmol·L~(-1),d NTP用量在0.1?0.2 mmol·L~(-1)μL/25μL反应体系中,可以经济且高效的实现对烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的特异性同步检测。     

基于ITS序列大豆茎褐腐病菌的PCR鉴定

提取了分别来自11个种共13株真菌(都是大豆上的常见病害的病原菌)的DNA.采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增,并对大豆茎褐腐病菌的PCR产物进行测序.根据所得大豆茎褐腐病菌与其常见易混淆品所在属在ITS区的基因序列比较分析,设计并合成了1对特异性引物.采用此对引物,只有大豆茎褐腐病菌能扩增出500 bp条带,检测的灵敏度达到4.2 pg/μL.将此对引物应用于人工接种大豆茎褐腐病菌大豆的检测,结果表明,此方法能够成功区分大豆茎褐腐病菌及其近似种.     

新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

[目的]建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据.[方法]针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali,污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveu和Valsa.malicola的rDNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物.[结果]属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带,检测灵敏度为10 pg/mL;设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.nivecum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308bp的条带,检测灵敏度均为10 pg/mL.[结论]采用腐烂病菌Valsa的rDNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法,可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测.     

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii (Campanile) Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃ 3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。     

蒿属植物提取物对棉花枯萎病菌和红腐病菌的抑制活性研究

在实验条件下,采用菌丝生长速率测定法,以棉花枯萎病菌、棉红腐病菌为供试菌,对菌陈、黄蒿、艾蒿等3种蒿属植物提取物的抗菌活性进行了研究.结果表明,供试3种蒿属植物提取物对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌均具有较好的抗菌活性,其中尤以艾蒿提取物的抗菌活性强而稳定,48～96h对上述两病菌的菌丝抑制率均达80%以上;丙酮提取物的抗菌活性强于乙醇提取物,前者的EC50为1.4785 mg/L,后者的为3.2090 mg/L.间歇振荡法、超声波法、冷浸法提取物对供试菌的72 h菌丝抑制率分别为84.34%、84.56%、88.70%,可见同种溶剂不同提取方法所得提取物抗菌活性基本一致.     

不同培养条件对玉米茎腐病菌生长的影响

为了筛选玉米茎腐病菌的培养材料,采用添加玉米不同部位样品的加富培养基,研究加富培养基不同添加成分对玉米茎腐病菌菌丝生长的影响;以不同粒径玉米、高梁子粒作为培养料,研究不同培养料对玉米茎腐病菌菌丝生长的影响.结果表明添加玉米粉、玉米鲜叶的加富培养基适宜玉米茎腐病菌菌丝生长;玉米茎腐病菌的培养料以大粒径玉米为最优;当培养料...     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

葡萄白腐病菌对多菌灵抗药性研究

建立了葡萄白腐病菌对多菌灵的相对敏感基线[1,2],评价了辽宁地区该病菌对多菌灵的敏感性,明确了病菌抗药性水平、分布,已检测出葡萄白腐病菌对多菌灵的中抗和高抗菌株。葡萄白腐病菌对多菌灵的抗性值得关注。     

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。     

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为研究细黄链霉菌诱导黄芩对黄芩根腐病菌的抑制效果,采用不同浓度细黄链霉菌发酵液、无菌水(CK)分别浸泡黄芩幼苗的根8h,幼苗移栽后在黄芩幼苗根部接种5 mL黄芩根腐病菌菌悬液,待幼苗生长至4叶期时,不同时间内测定黄芩叶片的CAT、POD和AAO活性.结果表明,不同浓度细黄链霉菌发酵液对黄芩叶片中CAT、POD、AAO活性的影响比较显著,随着细黄链霉菌发酵液浓度的减小,黄芩叶片中CAT、POD、AAO活性总体的趋势先增加后减小;当细黄链霉菌发酵液稀释到50倍时,黄芩叶片中POD、AAO活性一直比其他浓度的发酵液诱导的黄芩叶片中POD、AAO活性强,而黄芩叶片中CAT活性除了在12 h和24 h外,其余时间均高于其他浓度的发酵液诱导处理.细黄链霉菌发酵液诱导黄芩,其体内的CAT、POD、AAO活性均高于CK,说明细黄链霉菌对黄芩根腐病菌的抗病性比较显著.     

大蒜白腐菌粗毒素活性分析与组分鉴定

以大蒜白腐菌为材料,分别用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到了大蒜白腐病菌粗毒素,采用气相色谱对粗毒素进行了物质组分分析.结果表明,用正丁醇提取的大蒜白腐病菌粗毒素活性高于乙酸乙酯提取的大蒜白腐病菌粗毒素,但二者均可引起大蒜叶片病斑产生,表明其具有生物活性;其中有4种物质被鉴定,分别为2,4-二甲基庚烷、十一烷、3,5,5-三甲...     

应用多重PCR检测烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌

通过筛选特异性引物,优化多重PCR体系中的Mg2+、d NTP Mixture、Taq DNA聚合酶浓度,退火温度等反应条件,建立了多重PCR同时检测4种病菌(烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技术体系,得到265、364、400和541 bp共4条特异性条带,对应的病菌分别为猝倒病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.该检测体系的灵敏度可达10-2ng·μL-1基因组DNA.     

松干基褐腐病菌的分子检测方法

松干基褐腐病菌是我国重要的植物检疫性病原菌,为建立该病原菌准确、灵敏、快速的检测方法,根据该病菌与同属内形态与寄主上最接近的4个种的ITS差异区域,设计出一对特异性引物IW1、IW2,经PCR扩增,只有松干基褐腐病菌可得到约165 bp的产物,而其余作为对照的菌株均无此产物,其检测灵敏度为100 pg基因组DNA。此外,特异性引物IW1和IW2还适合于Real-timePCR,其检测灵敏度更低,为0.1 pg基因组DNA（20μL反应体系）。应用此2种方法均能成功的从人工污染了的松干基褐腐病菌的木块中检测出病原菌。     

深圳市黄颡鱼兽药残留状况分析

摘要：目的 了解深圳市黄颡鱼兽药残留状况,促进深圳市黄颡鱼质量安全可持续发展。方法 采集黄颡鱼100批次,采用液相色谱-串联质谱法对黄颡鱼样品中多种兽药残留进行定量检测,并对检测结果进行分析和评价。结果 在深圳市的黄颡鱼中共检出4种兽药,检测结果表明部分黄颡鱼样品检出隐色孔雀石绿和呋喃唑酮两种禁用兽药,恩诺沙星和环丙沙星作为限用类兽药,检出率较高,分别为35%和40%,且有4批次样品检测结果超过了国家标准规定的限量值 100 μg/kg,为不合格样品。结论 目前深圳市黄颡鱼可能存在使用违禁兽药以及超量使用限用药物等情况,建议监管部门加强各环节的监督管理,有效保障供深黄颡鱼的质量安全。     

比色法测定壳聚糖对玉米细菌性茎腐病菌的抑制作用

通过选择合适的波长建立了玉米细菌性茎腐病菌(Erwiniachrysanthemipv.zeae)悬浮液浓度与吸光值间的标准曲线,在LB液体培养基中分别设置6种壳聚糖浓度(0、0.5、1.0、2.0、3.5、5.5mg/mL),用比色分析法测定了各浓度下玉米茎腐病菌的生长状况,并建立生长曲线。通过生长曲线分析表明壳聚糖对玉米茎腐病菌具有显著的抑制作用,且作用强度随壳聚糖浓度的提高而增强。     

向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

[目的]建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi(Persoon)Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法.[方法]用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品.[结果]序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97;.针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370bp.[结论]成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法.