水稻细菌性条斑病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I荧光染料为指示剂,针对水稻细菌性条斑病菌糖基转移酶,设计了4条普通LAMP引物,并在此基础上设计了2条LAMP环引物,建立了水稻细菌性条斑病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。结果表明:水稻细菌性条斑病菌呈荧光的阳性反应,近缘菌株则呈橙色的阴性反应;检测灵敏度DNA为100 fg/μL,菌悬液为3×103 cfu/m L。LAMP技术的建立为现场检疫和大规模检测提供了新的方法。     

快速鉴定草莓枯萎病的LAMP检测技术

[目的]建立草莓枯萎病的镰刀菌快速检测方法.[方法]利用环介导等温扩增技术(LAMP)针对镰刀菌保守区域ITS设计一套LAMP扩增引物,利用Bst DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,对7种常见病原菌进行检测,分析LAMP引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的敏感性.[结果]建立的LAMP法能够特异性的检测尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌,并且检测灵敏度为1.0×10-4 ng/μL,是普通PCR检测灵敏度的1000倍.[意义]试验所建立的草莓枯萎病快速LAMP检测方法,具有灵敏度高、快速及简便的优点,可以向基层单位推广使用.     

环介导等温扩增实时荧光检测玉米内州萎蔫病菌

选择玉米内州萎蔫病菌基因组DNA高度特异保守区域设计环介导等温扩增技术(LAMP)引物,通过对其反应条件优化,建立玉米内州萎蔫病菌的LAMP检测体系。实验得出内引物与外引物最佳比例为6∶1,反应最佳温度为64℃。运用玉米内州萎蔫病菌克隆质粒梯度稀释液对LAMP检测体系的灵敏度进行了验证。LAMP检测体系的检测限达到100 fg,与常规PCR相比,该方法的检测限提高了100倍。以多种参比菌DNA为模板对LAMP检测体系的特异性进行了验证,结果表明LAMP检测体系仅对玉米内州萎蔫病菌有扩增,对非靶标菌没有扩增。为玉米内州萎蔫病菌快速高效检测提供了一种新型的检测方法。     

基于致病基因序列的LAMP方法检测番茄种子携带的溃疡病菌

本研究选取番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,Cmm)致病岛上的chpC基因的部分序列,作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)靶标片段进行LAMP引物设计。对反应体系优化后进行特异性测定,结果表明供试的89株番茄溃疡病菌中86株检测结果为阳性,3株为阴性,供试的14株非番茄溃疡病菌(其他重要植物病原细菌)均为阴性。检测番茄溃疡病菌菌悬液样品的阈值为4.8×10~5 CFU·mL~(-1),对DNA样品的检测阈值为1.8×10~(-2) ng·μL~(-1),并据此建立了番茄溃疡病菌的LAMP检测方法。将该方法应用于番茄种子携带Cmm的检测,通过提取种子浸提液样品的总DNA,实现了对番茄种子携带Cmm的直接检测。与普通PCR相比,该方法更加快捷简便,不依赖PCR仪等昂贵的仪器设备,可以丰富现有的番茄溃疡病菌分子检测体系,为口岸等检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。     

玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法

为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。     

柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立

传统PCR方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果.本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术.根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278 bp的靶带,PCR反应的检测下限为25个细胞/25 μL或2.75 pg/25 μL.EMA-PCR结果表明:当卤钨灯曝光时间1 min,EMA终浓度为1.0 mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当EMA的浓度小于30 mg/L时,EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制.EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/PCR范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系.基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段.     

苹果轮纹病菌LAMP快速检测方法的建立

为建立快捷、灵敏检测苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea的环介导等温扩增(loop-medi‐ated isothermal amplification,LAMP)检测方法,以其内转录间隔区ITS序列为靶标,设计6条LAMP引物,对其特异性进行检测,优化反应条件并建立苹果轮纹病菌的LAMP检测方法。引物特异性检测结果表明,2株苹果轮纹病菌反应结果呈绿色为阳性,而其它3株对照菌株反应结果呈橙色为阴性,表明了LAMP检测引物的高特异性。优化后的LAMP最佳反应条件:温度65℃、扩增时间60 min、FIP/BIP、F3/B3、LF/LB引物终浓度分别为1.0、0.25、0.5μmol/L。LAMP检测方法对苹果轮纹病菌DNA的检测灵敏度达到了100 ag/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。田间疑似轮纹病组织检测结果发现LAMP方法对苹果轮纹病菌的检出率高达68%,而传统分离鉴定方法的检出率仅为24%。表明所建立的苹果轮纹病菌LAMP快速检测方法简便快捷、特异性好、灵敏度高,尤其适用于基层植保机构对于苹果轮纹病菌的田间快速检测。     

基于环介导等温扩增技术检测瓜类细菌性果斑病菌

本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物Ac-F3/Ac-B3和Ac-FIP/Ac-BIP,建立了西瓜嗜酸菌的LAMP检测体系。利用该体系在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强,其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。     

番石榴焦腐病菌LAMP检测方法的建立及应用

 以钙黄绿素（calcein）为指示剂,建立了番石榴焦腐病菌（Botryosphaeria rhodina）的环介导等温扩增（Loop mediated isothermal amplification, LAMP）可视化快速检测方法。在该方法中,以番石榴焦腐病菌特异的核糖体转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS）序列为目的DNA片段,设计4条引物（2条内引物、2条外引物）,优化LAMP反应条件和反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。研究确定最佳反应温度为64℃,反应时间1 h;特异性检测结果显示,15株不同地理来源的番石榴焦腐病菌和10份番石榴焦腐病病果组织LAMP产物均为阳性（绿色）,而26株其它病原菌及10份健康番石榴果实组织LAMP产物均为阴性（橘黄色）;灵敏度验证结果显示,该方法的检测灵敏度在DNA水平上可达到10 pg。实验结果表明,快速、准确、灵敏的LAMP检测方法适合基层部门及田间检测番石榴焦腐病菌使用。     

利用环介导等温扩增方法快速检测瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性溃疡病菌

为建立简单、快速和灵敏地检测瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli(Aac)和番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis(Cmm)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,以Aac的ugpB基因和Cmm的micA基因为靶标,分别设计、合成和筛选特异性引物,摸索和优化各项反应条件和反应体系,成功建立了以钙黄绿素颜色为指示且只需要金属浴恒温反应30～60 min的LAMP扩增体系。特异性分析表明该LAMP方法可以快速检出5株不同的Aac菌株和2株不同的Cmm菌株,其它对照菌株如燕麦嗜酸菌燕麦亚种A. avenae subsp. avenae、丁香假单胞菌Pseudomonas syringae、水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae和茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum则呈现阴性反应;引物比目前报道的LAMP引物有更高的DNA样品检测灵敏度,Aac和Cmm的灵敏度分别为1.72×10~2fg/μL和1.26×10~2fg/μL。研究结果表明,所设计的Aac和Cmm引物特异性好、灵敏度高,更有利于从源头上控制这2种检疫性细菌病害的流行和传播。     

环介导等温扩增技术在植物病原物检测中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的由环介导的等温核酸扩增分子技术,不仅特异性强、操作简便、成本低,还能快速、高效地检测病原物,为植物病害的防控提供更精准的防治适期,从而可以减少农药的滥用。本文主要针对LAMP技术的原理、发展、优缺点、在真菌、细菌、病毒等多种植物病原物检测及在抗药性检测中的应用进行总结,并结合国内外研究进展对其应用前景进行了分析。     

基于LAMP方法的苜蓿疫霉根腐病菌分子检测研究

苜蓿疫霉根腐病菌是我国检疫性有害生物之一.但是,目前国内尚无检测标准.笔者针对该病菌特异分子标记,设计了LAMP引物,建立了苜蓿疫霉根腐病菌恒温快速检测方法(巳申请发明专利).该方法快速、准确、无需PCR仪,很好地满足了口岸检疫部门的检测要求.     

玉蜀黍黑粉菌环介导等温扩增检测体系的建立及应用

 本文根据玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis )的UmPep1、UmPit2和UmSee1基因各设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出1套引物对LAMP反应体系进行3因素(Bst DNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、内外引物浓度比)3水平的优化试验。并对优化的U. maydis LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及田间检测可行性试验。特异性试验表明,该方法能特异性检测U. maydis,而与其他病原菌的DNA没有交叉反应;灵敏度试验表明,该反应体系的最低检出限为44 fg·μL^-1 pEasy-Pep质粒DNA,制作的标准曲线可对U. maydis进行定量分析。该方法也适用于在U. maydis侵染前或侵染早期对田间样品进行检测,对现场采集的172份田间样品进行检测,其中140个样品显示为阳性。本研究所建立的LAMP体系具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在45 min内完成对田间样品的检测,是快速、定量检测U. maydis的有效手段。     

佳多自动虫情测报灯的研制与应用研究初报

佳多自动虫情测报灯是新开发的一种虫情自动观测工具,经初步应用观测,证明该灯具有诱测害虫种类多、数量大、效果好、自动化程度高、使用安全等特点,可有效提高虫情监测的时效性和预测的准确性,并减轻测报人员工作强度,符合病虫测报标准化、网络化、自动化和可视化的发展要求.在总结该灯对害虫诱测效果的基础上,提出了其应用于系统害虫观测的建议.     

豇豆疫霉LAMP检测方法的建立

本研究以豇豆疫霉Phytophthora vignae Purss核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶标片段,设计4条特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法。特异性检测结果表明:8株不同地理来源的豇豆疫霉菌株LAMP检测均为阳性(绿色),扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他11种卵菌近缘种及12种常见病原真菌和细菌共42个菌株均未观察到这些现象。灵敏度分析显示:该方法检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg/25μL。采用LAMP方法对福建建瓯和宁德采集的62份疑似豇豆疫病病株样本进行检测,并用组织分离方法进行验证。结果表明,LAMP和组织分离方法的检出率分别为67.7%(42/62)和61.3%(38/62)。综合以上结果,LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单的特点,适合基层部门用于田间豇豆疫霉快速检测。     

香蕉条斑病毒LAMP快速检测方法的建立

 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究以香蕉条斑病毒（Banana streak virus,BSV）ORF3保守区域为基础针对6个特定区域设计并筛选了4条LAMP扩增引物,通过对LAMP反应中MgSO₄、dNTPs、Betaine等主要试剂浓度进行优化,建立了香蕉BSV的LAMP检测方法,63℃反应90 min后通过在反应产物中添加SYBR Green Ⅰ染料后颜色的变化,肉眼即可判断检测结果。LAMP具有极高的检测特异性和灵敏性,其检测下限约为3.2 ng·μL^-1,是PCR检测灵敏度的25倍,能快速、准确地对疑似样品进行检测,本研究对华南地区部分疑似样品的检测结果显示LAMP阳性检出率比PCR检出率高。本文建立的BSV LAMP检测方法是对BSV检测方法的拓展和延伸,为香蕉病毒的快速检测提供技术保障。     

核酸环介导等温扩增技术及其在植物检疫中的应用

介绍核酸环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景.环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可部分替代普通PCR,日后伴随着不断改进、完善和标准化,必将在植物检疫上有广阔的应用前景.     

木薯细菌性萎蔫病菌的LAMP快速检测方法

建立了一种木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增快速检测方法,为木薯细菌性萎蔫病的快速检测提供有力的技术支持。针对木薯细菌性萎蔫病菌TAL效应器蛋白质(pthBXam)靶序列的6个位点设计4条特异性引物,并对反应温度和内引物浓度等参数进行了优化,设计的引物与试验中提供的其他黄单胞近缘种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。LAMP方法对木薯细菌性萎蔫病菌菌株DNA的检测下限为1pg/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。该方法采用SYBR Green I染料法对扩增产物闭管检测,裸眼观察颜色变化判断反应结果,能快速、准确地对田间样品进行检测,没有出现假阳性和假阴性。与其他检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,降低了设备投入,易于操作,适合木薯细菌性萎蔫病菌的现场检疫和大规模监测。