SYBR~ Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明：应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2（±0.5）。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR~ GreenI实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR(R)Green I实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR(R) Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系.结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.     

SYBR Green Ⅰ荧光检测痕量宿主DNA

基于SYBR Green Ⅰ荧光染料与双链DNA结合产生荧光的原理,建立一种痕量DNA荧光检测方法.采用不同稀释倍数的SYBR Green Ⅰ荧光染料做DNA的标准曲线,确定SYBR Green Ⅰ荧光染料的最佳稀释倍数.比较荧光法和Southern blotting杂交法定量DNA.结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光染料稀释倍数为1:10 000时线性范围广,线性关系好(R2=0.9999);荧光法和Southern blotting杂交法可以相互印证.由此可知,SYBR Green I荧光法定量DNA是一种快速、稳定的痕量DNA检测方法.     

SYBR Green Ⅰ实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物，应用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明，应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过溶解曲线确定其熔点值为（80．2±0．5）℃，而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

PCR方法快速鉴别绞股蓝与乌蔹莓

建立绞股蓝与乌蔹莓2种中药相互鉴别的特异性PCR方法,利用SYBR Green I染料法建立对绞股蓝与乌蔹莓的快速鉴别方法。采集不同产地的绞股蓝与乌蔹莓各9份,通过对其叶绿体DNA中trnL-F片段进行扩增、测序,进行多重序列比对后,根据其变异位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并通过加入SYBR Green I染料法建立对2种中药进行快速检测方法,本研究建立了对绞股蓝与乌蔹莓2种中药进行分子鉴别方法,并建立了荧光快速检测方法。     

SYBR(R) Green Ⅰ实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR(R)Green Ⅰ实时PCR方法.同时针对油菜FatA基因设计出内源基因.结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR(R)Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5).SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法.     

SYBR Green Ⅰ荧光检测痕量宿主DNA

基于SYBR Green Ⅰ荧光染料与双链DNA结合产生荧光的原理,建立一种痕量DNA荧光检测方法.采用不同稀释倍数的SYBR Green Ⅰ荧光染料做DNA的标准曲线,确定SYBR Green Ⅰ荧光染料的最佳稀释倍数.比较荧光法和Southern blotting杂交法定量DNA.结果表明,SYBR Green Ⅰ...     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

转基因大麦B-hordein基因荧光定量PCR方法的建立

为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达，利用SYBR Green I 染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量，通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段，对PCR退火温度、引物浓度等进行优化，结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明，转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P ＜ 0.05)，B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01) ℃和(80±0.01) ℃处显示特异性单峰，可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I实时定量PCR法。     

山羊痘病毒SYBRGreen I荧光PCR检测方法的建立

为建立山羊痘病毒（goat pox virus,GPV）的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeat,ITR）的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR GreenI模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明,此次建立的检测GPV的SYBR Green I荧光PCR方法能检测出7×10^2拷贝数的DNA模板,此法比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。     

大鲵柱状黄杆菌SYBR Green I 荧光定量PCR 诊断试剂盒的研制

根据GenBank中柱状黄杆菌16SrRNA 序列,设计1对特异性引物,PCR 扩增获得16SrRNA 基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR 诊断方法,以此为基础研制试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12 拷贝/μL。结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测。     

乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快速检测乙型脑炎病毒JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据Gen Bank数据库中JEV Henan-09-03毒株(Gen Bank ID:GQ336809.1) E蛋白序列,设计了3对特异性LAMP引物,建立Bst DNA Polymerase等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测JEV。本方法通过在扩增产物中加入SYBR Green I染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断JEV扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达5copies·m L-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。     

土壤中黑胫病菌荧光定量PCR快速检测体系的建立及初步应用

为建立土壤中黑胫病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,依据疫霉菌特异性par A1基因序列差异位点,设计1对特异性引物。通过构建含有目的片段的重组质粒,建立标准曲线,以SYBR GreenⅠ荧光染料法对烟草黑胫病菌进行荧光定量PCR检测,检测灵敏度达1×102个/g土壤,建立了基于SYBR GreenⅠ荧光染料法的荧光定量PCR的快速定量检测体系,并对云南、四川烟草主要栽培区土壤进行检测。表明该体系可以对烟草不同时期的田间土壤黑胫病菌的数量进行动态监测,可用于烟草黑胫病的预测和防治。     

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。     

实时荧光PCR法快速检测地中海实蝇的研究

[目的]设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物,建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法.[方法]采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段,经测序、比对分析,设计出扩增地中海实蝇的特异性引物,用SYBR Green实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度.[结果]设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇,扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2.该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3 ng/μL.[结论]所建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高.     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

变形杆菌环介导等温扩增检测法的可视化方法的比较

通过比较现有几种可视化检测环介导等温扩增反应产物的方法,建立一种可视化检测变形杆菌的方法。利用已有的LAMP检测变形杆菌的方法作为出发检测体系,比较了焦磷酸镁反应沉淀观察法和分别单独添加核酸染料SYBR Green I、孔雀绿(Malachite Green)、钙黄绿素-氯化锰(Calcein-MnCl2)的可视化检测方法,结果显示,焦磷酸镁沉淀的指示效果较差,SYBR Green I法会造成实验场所的交叉污染,孔雀绿法指示反应不够灵敏,钙黄绿素-氯化锰法综合考虑较优;并证明该方法用于可视化LAMP检测变形杆菌,具有良好的特异性,灵敏度达到4.8CFU/mL。试验证明钙黄绿素-氯化锰法是一种较优的LAMP可视化检测法。