细粒棘球蚴Eg HSP20蛋白基因的分子特征、表达及其反应原性研究

【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

胞内分枝杆菌HBHA基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。     

绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。     

肝片吸虫CatL1D蛋白的免疫原性研究

【目的】研究绵羊肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)CatL1D蛋白的分子特征和免疫原性。【方法】利用RT-PCR技术扩增出CatL1D基因,用相关软件分析其编码蛋白的生物学信息。将CatL1D基因克隆入表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-CatL1D,进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切和测序鉴定。将pET-CatL1D载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析;以纯化后的重组蛋白CatL1D为抗原免疫小鼠,利用间接ELISA方法检测抗体效价,分析其免疫原性。【结果】成功克隆了CatL1D基因,该基因全长981 bp,编码326个氨基酸,其中第21-79位氨基酸为组织蛋白酶前肽抑制剂结构域,第108-321位氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶保守结构域;CatL1D蛋白含有6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、11个豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点,含有10个优势抗原表位。成功构建了pET-CatL1D原核表达载体,诱导表达出CatL1D重组蛋白;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白CatL1D分子质量为51 ku,以包涵体的形式表达,具有较强的反应原性。间接ELISA法检测结果表明,重组蛋白CatL1D免疫小鼠血清抗体效价可达1∶102 400,证实其具有良好的免疫原性。【结论】Fh重组蛋白CatL1D具有较强的抗原性,有开发为早期诊断抗原和亚单位疫苗的潜力。     

绵羊肺炎支原体膜蛋白p56基因的克隆、表达及反应原性研究

为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。     

细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。     

毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表达及蛋白纯化

【目的】对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4进行原核表达及重组蛋白纯化,为进一步研究该基因的酶学特征和生理功能打下基础。【方法】从毛果杨中克隆两个半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4,构建其原核表达载体p ET-30a-Pt CP_2及p ET-30a-Pt CP4,并在转入大肠杆菌后在体外诱导表达重组蛋白,采用包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。【结果】Pt CP_2基因CDS序列全长1107 bp,编码368个氨基酸;Pt CP4基因CDS序列全长1104 bp,编码367个氨基酸。Pt CP_2和Pt CP4基因编码的蛋白均属于RD19A-like类型木瓜蛋白酶。Pt CP_2和Pt CP4基因在毛果杨根、茎、叶中均有表达,其中Pt CP_2在叶中表达量最高,Pt CP4在根中表达量最高。通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4,切除信号肽后蛋白酶大小分别为38.151和38.069 k D。【结论】原核表达获得的纯化重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4可用于进一步研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶的酶学特征和生理功能。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

细粒棘球蚴TP_x蛋白的分子特征与反应原性

为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节为总RNA模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,经测序验证后亚克隆至表达载体pET-32a中,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及反应原性分析。结果表明:Eg TP_x cDNA全长为582个核苷酸,编码193个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个N端酰基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点,4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;抗原表位区集中在58~94位和160~188位。重组菌可表达分子量为37ku的重组蛋白,重组蛋白Eg TP_x抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

 【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

版纳微型猪近交系细胞色素P450家族基因CYP1A1克隆及生物信息学分析

【目的】克隆版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)细胞色素P450家族基因CYP1A1的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。【方法】利用RT-PCR方法获得CYP1A1基因的全长CDS序列,运用生物信息学对其核酸及蛋白序列进行分析,构建系统进化树。【结果】获得的BMI CYP1A1 CDS长度为1551 bp,编码516个氨基酸,蛋白质分子量为58.39 ku,等电点为7.83,位于内质网的概率是94.1%。CYP1A1蛋白质含有1个细胞色素P450半胱氨酸血红素配体位点,1个N-豆蔻酰化位点,1个酰胺化作用位点,2个N-糖基化位点、6个蛋白酶C磷酸化位点和5个蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。11个物种构建的系统进化分析表明,BMI(猪)CYP1A1与牛和山羊的关系最近。【结论】以上结果将为进一步研究版纳微型猪近交系CYP1A1基因功能奠定基础。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究.ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku.序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点.PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究SpltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础.     

桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达

根据Gen Bank中的副猪嗜血杆菌hhd A的基因序列,设计并合成l对特异性引物,对从江西分离的HPS的hhd A基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。测序结果表明,扩增的目的基因大小为1 797bp,共编码氨基酸599个氨基酸。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384.1)中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性99.6%。生物信息学分析表明,HPS hhd A蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲;综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhd A蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,将重组质粒转化到BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80 k D。为进一步研究HPS hhd A生物学功能及抗体制备和开发hhd A基因工程产品奠定了基础。     

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。     

核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

 【目的】利用核型多角体病毒（NPV）的p74基因与苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌。【方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。【结果】XBU-H1Acp74可表达130 kD的Cry1Ac蛋白和50 kD的P74蛋白,生测显示P74蛋白可以协同Cry1Ac的杀虫效果。【结论】本研究成功构建了cry1Ac基因与p74基因融合的Bt工程菌,为进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株,研制出高效、广谱、安全的杀虫剂提供了新的技术途径。     

H9N2亚型禽流感病毒河南株NP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆H9N2亚型禽流感病毒(AIV)河南株核蛋白(NP)基因,并将NP主要抗原表位区在大肠杆菌中进行表达,为禽流感基因工程诊断抗原的制备和开发奠定基础。【方法】根据GenBank公布的禽流感病毒NP基因序列设计引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从H9N2亚型AIV河南株感染的鸡胚尿囊液RNA中扩增AIV河南株NP全基因,将扩增的PCR产物克隆到pGEM-T easy载体并进行测序。通过PCR和酶切方法将NP主要抗原表位区亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达重组蛋白。【结果】测序结果表明,克隆的H9N2亚型AIV河南株NP基因全长为1497bp,包含1个完整读码框,编码498个氨基酸,与GenBank中不同来源、不同亚型的其他7株禽流感病毒NP基因的核苷酸同源性达到95%以上,氨基酸同源性达到98%以上。SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为42 ku的重组蛋白。经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组蛋白的表达量最高。Western blot分析表明,重组蛋白能够与H9亚型AIV阳性血清发生特异反应。【结论】NP基因非常保守,建立的表达系统能够表达NP蛋白且表达蛋白具有良好的免疫原性。     

秦川牛A-FABP基因的生物信息学分析

【目的】克隆秦川牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因,并对其进行生物信息学分析,为深入研究A-FABP基因与秦川牛肉质性状的关系奠定基础。【方法】以秦川牛脂肪组织为材料,采用RT-PCR方法对牛A-FABP基因进行克隆。使用DNAMAN、NCBI等一系列在线软件及工具,对所得到的序列及其编码蛋白质的结构和特性等进行生物信息学分析。【结果】秦川牛A-FABP基因含有15个酶切位点,编码的蛋白分子质量为14.7 ku,二级结构主要以α-螺旋、不规则盘绕和延伸链为结构元件,含132个氨基酸,其中强碱性氨基酸18个,强酸性氨基酸19个,疏水氨基酸45个,不带电荷的极性氨基酸32个;含有6个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个肉豆蔻酰基化位点,1个FABP结合域;含有4个Ser、6个Thr和1个Tyres,这11个氨基酸均可能成为蛋白激酶磷酸化位点。【结论】秦川牛A-FABP基因编码的氨基酸序列与人、鸡、小鼠、大鼠、野猪的氨基酸序列同源性分别为84.09%,85.61%,71.97%,88.33%,81.82%,表明在进化关系上,A-FABP氨基酸序列有较好的保守性;此蛋白序列具有脂钙蛋白结合域,没有信号肽;无明显跨膜区,不含有二硫键。