鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

鹅催乳素受体基因cDNA 2种新5′-UTR特征分析

应用5′-RACE技术,在成年雄鹅睾丸中克隆到长度分别为361 bp、499 bp和594 bp 3种催乳素受体基因(gPRLR)cDNA 5′-端片段,表明雄鹅睾丸至少表达3种gPRLR mRNA.3种5′-端序列含有长度分别为210 bp、348 bp及443 bp的不同5′-UTR.3种5′-端序列后195个核苷酸一致,与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA第3和第4a外显子高度同源.3种5′-端序列起始密码子ATG均位于第3外显子45～47 bp处,与cPRLR cDNA起始密码子同一位置.348 bp与443 bp 5′-UTR结构相似.348 bp 5′-UTR中,第3外显子上游依次是235 bp和69 bp,其中69 bp与cPRLR cDNA第2外显子高度同源.443 bp 5′-UTR比348 bp 5′-UTR多插在235 bp和69 bp之间的95 bp.这些结果表明,含348 bp和443 bp 5′-UTR的mRNA来源于同一初级转录本转录后的选择性剪接.与348 bp和443 bp 5′-UTR不同的是210 bp 5′-UTR在第3外显子的上游含有一个不同的166 bp序列.这表明含210 bp 5′-UTR的mRNA来源于另一初级转录本348 bp 5′-UTR或443 bp 5′-UTR mRNA.     

黄颡鱼bmp2a与bmp4基因启动子的克隆及分析

为研究黄颡鱼bmp2a与bmp4基因的功能及其相关转录因子的调控网络,采用RLM-5′RACE方法确定bmp2a与bmp4基因的转录起始位点,通过hiTAIL-PCR方法克隆bmp2a与bmp4基因启动子序列并运用生物信息学方法预测启动子序列上的关键转录因子结合位点。结果显示,bmp2a与bmp4基因的转录起始位点分别位于bmp2a与bmp4基因编码区上游的391bp与351bp处。克隆bmp2a与bmp4的1 830bp、1 962bp启动子序列,在启动子序列的基础上预测出AP1、SP1、E-box、GATA1、CREB、PPARγ、SOX5、SOX6和SOX9等转录因子的结合位点,提示这些转录因子对bmp2a与bmp4基因的转录调控发挥潜在的重要作用。     

小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析

采用LA-PCR技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明:试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒;经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高,在转录起始位点近端的启动子区域中小鼠与人、牛、乌鳢的同源性分别为41.36%,37.89%,38.71%;经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、NF-1、CBF-B等转录因子结合位点,有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因5′侧翼序列的克隆与分析

根据三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)5′端序列设计特异引物,采用反向PCR技术从三角叶滨藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855bp的片段。距起始密码子ATG77bp处的T碱基为可能的转录起始位点。在-25～-30bp、-260～-265bp、-337～-342bp以及-715～-720bp含有推测的TATA box(TATAAA),在-389～-393bp和-720～-724bp含有推测的CAAT box(CCAAT),以及在-112～-116bp和-397～-401bp含有推测的ABA作用元件CACGT。仅其-178～-1bp区与中亚滨藜BADH基因启动子区高度同源,同源性为90%。该BADH基因5′侧翼区与其它植物BADH基因的启动子区无同源性。     

中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子克隆及序列分析

为获取中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子并分析调控元件,以前期获得的中华蜜蜂AcerOr1基因的cDNA序列为模板,设计特异性引物并采用染色体步移的方法,从中华蜜蜂基因组中克隆到AcerOr1基因部分序列及其5'侧翼区,并分析其调控元件组成。生物信息学分析结果表明,克隆产物长1 831 bp,3′侧翼序列与Gen Bank中AcerOr1基因序列的5'端序列同源性为92%;在1 100～1 139 bp处存在基础启动子,其序列为:5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAAAATGATTCATAAGT-3′,转录起始位点可能位于翻译起始密码子ATG上游621 bp处的碱基T,其可能性为0.98。除含有基本启动子元件(TATA-Box、CAAT-Box等)外,还存在与胚胎发育或组织发育相关的元件CF2-Ⅱ、NIT2、CdxA和与环境应激相关的元件HSF,表明AcerOr1基因在中华蜜蜂体内的转录和表达可能受到胚胎、组织及外界环境的调控。     

b-Boule基因5′调控序列的克隆与睾丸组织DMR甲基化分析

【目的】研究b-Boule基因5′调控序列的序列特征,以及牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织b-Boule基因DMR甲基化状态的差异,为揭示b-Boule基因的表达调控和犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】采用PCR扩增和克隆测序技术获得牦牛b-Boule基因5′调控序列,利用生物信息学方法分析b-Boule基因5′调控序列的序列特征,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织中b-Boule基因DMR的甲基化状态。【结果】b-Boule基因5′调控序列长度为1 352 bp,核心启动子区含有SP1等甲基化敏感位点,5′端存在一个CpG岛。犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平(17.78%)高于牦牛(7.50%)和黄牛(6.94%)(P<0.01),特别是CpG位点33—35的甲基化水平差异更明显。【结论】犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平高于牦牛和黄牛,结合前期mRNA表达水平和组织学观察结果,认为DMR甲基化在b-Boule基因的表达调控中发挥关键作用,犏牛b-Boule基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

Cloning and multiple transcript analysis of Ms5 gene in kenaf(Hibiscus canabius L.)

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5 ′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆.序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1105 bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5 -β.这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4 ku,理论等电点为7.62;两者5 ′端前972 bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972 bp以后比HcMs5-α多出133 bp的序列,具有选择性转录终止的特征.这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关.     

鹅催乳素受体基因cDNA5′端序列克隆

为寻找鹅就巢性相关基因,从洪泽湖性成熟公鹅睾丸组织分离并合成鹅cDNA第一链;利用RACE克隆了鹅催乳素受体基因(gPRLR)5′端序列。所克隆的499 bp 5′端序列可划分为348 bp的5′-UTR、151 bp的以ATG作为起始密码子的阅读开放框。与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA序列作比对,此499 bp序列可划分为238 bp的第1外显子、69 bp的第2外显子、114 bp的第3外显子及81 bp的部分第4外显子,起始密码子位于第3外显子45 bp处。阅读开放框核苷酸序列与cPRLR cDNA同源部位的阅读开放框同源性达到88%,推导的氨基酸序列同源性达到84%。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的克隆与序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出0.35kb的鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的基因片段.序列分析表明,该区域含有2个睾酮激素受体识别位点和2个皮质酮激素受体识别位点,具备输卵管定位表达调控增强能力,为构建融合定位表达启动子调控外源基因在鸡输卵管定位表达奠定了基础.     

斜纹夜蛾气味结合蛋白基因GOBP2转录调控区的克隆及活性分析

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。     

山羊β-酪蛋白基因调控区的克隆及启动子活性的检测

为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC island、CAAT box、SAR、AP1、Oct-1、Sm、Glyco、Pu-1、CAC等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点,并且5′调控区可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊CSN2基因5′调控区的有效性,表明克隆的调控区可用于乳腺生物反应器的研究。     

红麻Ms5基因的克隆及多转录本分析

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆。序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1 105bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5-β。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4ku,理论等电点为7.62;两者5′端前972bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972bp以后比HcMs5-α多出133bp的序列,具有选择性转录终止的特征。这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

牦牛乳球蛋白基因5'调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为5′-gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物5′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′.经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定.序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变.该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件.     

猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

 【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区（5′UTR）为启动子的萤光素酶表达载体，分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞Cos-7，检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。     

沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测

【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5′侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%,96%,93%,95%,90%和79%。对其5′侧翼序列2 000bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635--586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性。     

水牛 STAT5a 和 STAT5b 基因启动子克隆及其活性分析

为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.