生物转化制备活性维生素 D3的研究进展

维生素D3本身没有生物活性,在体内需经羟化生成活性维生素 D3才能发挥其生理作用。目前主要通过化学合成法和微生物转化法来生产活性维生素 D3。化学合成过程复杂、污染严重,不适合工业化生产。而生物转化法条件温和,特异性强,反应步骤少,在制备活性维生素 D3中具有重要意义。综述了参与维生素 D3代谢的哺乳动物 CYP450羟化酶、维生素 D3羟化菌株及生产过程中采用的基因工程方法,并展望研究方向的发展趋势。     

水牛体外培养早期胚胎中致密化相关基因mRNA的表达分析

为了研究致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中的mRNA表达情况,采用Taqman探针法和SYBR GreenⅠ染料法分别分析了缝隙连结蛋白43和31(Cx43、Cx31)、上皮钙调素蛋白(E-cad)3个基因在水牛体外成熟卵母细胞及培养的早期胚胎中的mRNA表达。结果发现,Cx43基因在水牛成熟卵母细胞中表达量最高,显著高于后3个发育阶段(P0.05);Cx31基因mRNA表达趋势与Cx43相反,成熟卵母细胞中表达量最低,囊胚期最高,随体外胚胎发育Cx31mRNA表达量逐渐增高;E-cad基因在体外培养的各阶段胚胎中mRNA表达无显著差异(P0.05)。以上结果表明,3个致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中均有表达,但是具有明显不同的mRNA表达方式。     

生物法生产25-羟基维生素D3条件优化

[目的]优化25-羟基维生素D3[25(OH)VD_3]的转化条件,提高25(OH)VD3产量。[方法]通过单因素试验和正交试验对菌株UV-FY-141转化生产25(OH)VD_3的条件进行优化。[结果]确定其最佳发酵培养基:葡萄糖15.00g,蛋白胨20.00g,NaCl5.00g,CaCO_32.00g,FeSO_4·7H-2O0.01g,去离子水1000mL。优化后转化条件:发酵初始pH6.5,发酵温度为28℃,发酵时摇床转速为200r/min,发酵时间为72h。在优化条件下,25(OH)VD3产量由原来的9.460mg/L提高到13.130mg/L,提高了38.79%。[结论]采用优化后的转化条件,可显著提高25(OH)VD_3的产量。     

慢病毒介导的水牛CD14基因shRNA序列的筛选

研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。     

水牛 STAT5a 和 STAT5b 基因启动子克隆及其活性分析

为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.     

转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响

本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法，将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因（myostatin）药物正负筛选（PNS）打靶载体pLoxp-1．4K-4．3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中，而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现，脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法，但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小；采用与载体基因型相同的细胞系，两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10⁶TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇研究

[目的]以虾Y-器官微粒体7、8-脱氢酶催化胆固醇,制备7-脱氢胆固醇。[方法]通过单因素试验,研究影响转化反应的各种因素。[结果]将摘除眼柄的刀额新对虾（Metapenaeus ensis）Y-器官,匀浆、离心制备的微粒体酶液,于22℃与胆固醇避光反应6 h,可以积累相对较多的7-脱氢胆固醇。[结论]该研究为利用虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇奠定基础。     

荧光定量PCR分析水牛胚胎致密化相关基因表达方法的建立

胚胎致密化是哺乳动物早期胚胎发育过程中一个非常重要的环节,有研究发现致密化相关基因的表达水平与体外发育胚胎的质量之间存在着相互关联作用。为了分析水牛胚胎早期发育中致密化相关基因在mRNA水平上的表达并确定其定量分析方法,本研究根据黄牛有关基因序列设计了Cx43、Cx31、E-cad以及组蛋白基因(Histone H2A)引物序列,分析了黄牛和水牛致密化基因的同源性,并确定各目的基因在水牛胚胎的SYBR Green I实时定量PCR反应条件。     

水牛缝隙连接蛋白43基因克隆及表达

本研究克隆了水牛缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,对Cx43基因在水牛不同组织和不同发育阶段卵泡中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了水牛Cx43基因序列,其中编码区全长1152 bp,编码383个氨基酸,蛋白质理论分子质量43.13 ku,等电点为8.88。多重序列比对结果显示,水牛Cx43核苷酸序列与牛、羊、猪、马和人相应序列的同源性分别为99%、98%、94%、93%和92%,系统进化树分析结果推测,Cx43基因在不同物种进化过程中具有高度保守性;对水牛Cx43蛋白的二级和三级结构分析发现,其具有缝隙连接蛋白的特有结构。定量RT-PCR结果显示,Cx43在水牛卵巢组织中相对表达量最高,睾丸、肾脏、心脏和皮肤次之,肝脏和大脑表达量较低。免疫组化结果发现,Cx43蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,Cx43蛋白随卵泡发育表达逐渐增强。