产单核细胞李斯特菌的脉冲场凝胶电泳分型方法研究

建立产单核细胞李斯特菌的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法,对单核细胞李斯特菌的PFGE技术进行优化,以期获得条带亮度和清晰度都理想的脉冲图谱以及包含较多信息的分析结果;13株单核细胞李斯特菌经PFGE分析获得菌株的遗传进化树和相似性距阵.本研究建立的PFGE分型方法,为单核细胞李斯特菌的溯源追踪提供了很好的技术平台,对于其他革兰氏阳性菌PFGE分型方法的探索也具有重要的参考价值.     

PCR在快速检测食品单核细胞增多性李斯特菌中的应用

为应用PCR快速检测食品中的单核细胞增多性李斯特菌,设计合成了针对单核细胞增多性李斯特菌溶血素编码基因的特异性引物进行PCR扩增.结果表明,在单核细胞增多性李斯特菌中能扩增出348bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌的扩增结果均为阴性.用该方法检测了81份食品样品,检测结果与分离鉴定方法一致,表明本方法可用于食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速检测.检测样品中,单核细胞增多性李斯特菌污染率为8.6%,以禽肉类制品中的污染率最高.     

单核增生性李斯特氏菌mpl和plcB基因分布

为了研究mpl和plcB基因在单核细胞增生李斯特菌中的分布状况,为单核细胞增生李斯特菌的防治及追溯提供依据。本试验以分离自生肉、熟肉制品、冷冻食品、水产品、蔬菜等6类不同来源共105株单核细胞增生李斯特菌株作为研究对象,利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌mpl、plcB基因的分布进行检测。结果表明:所有菌株均有这2个基因中的一个或全部,总检出率为100%。其中,mpl基因总检出率为82.9%,plcB基因的总检出率为98.1%。食品来源不同,单核细胞增生李斯特菌mpl、plcB基因的检出率不同,且同一来源的菌株其mpl和plcB的检出率也不同,表明不同来源以及不同的毒力基因在单核细胞增生李斯特菌中的分布存在差异。     

单核细胞增生性李斯特氏菌virR和mprF基因分布

为了研究virR和mprF基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布状况,为单核细胞增生性李斯特氏菌的防治及追踪污染源提供依据,本试验以分离自石家庄、保定地区的生鲜肉、水产品、速冻食品等6类不同来源共189株单核细胞增生性李斯特氏菌菌株为研究对象,利用热启动PCR技术对virR和mprF基因的分布进行了检测。结果表明:virR基因的总检出率为92.1%,mprF基因的总检出率为96.3%,且同时含有这2个基因的概率为91.5%;食品来源不同,单核细胞增生性李斯特氏菌virR、mprF基因的检出率稍有差异,且同一来源的菌株其mprF的检出率都稍高于virR,这表明不同的基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布存在差异。     

应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL~(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg~(-1)、水和牛奶为400cfu·L~(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。     

两种乳酸菌及其发酵液对单核细胞增生李斯特菌生长的抑制作用

将单核细胞增生李斯特菌纯培养物分别与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行混合培养,观察乳酸菌对单核细胞增生李斯特菌的生物拮抗作用。结果表明,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显的抑制作用,并且作用效果随着培养时间的延长而增强;同时,还研究了不同pH值条件下,两种乳酸菌发酵液以及乳酸、盐酸、乙酸对单核细胞增生李斯特菌生长的影响。结果表明,发酵液对单核细胞增生李斯特菌的抑制效果受pH值影响显著。在pH8.0到pH11.0范围内,随着pH值的增加,乳酸菌发酵液的抑菌活性显著下降;乳酸、乙酸对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用强于无机酸(盐酸),其中,乙酸的抑制作用最强,且随其含量的增加,抑制作用增强。     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

芜菁子挥发油提取物对鲜切果蔬中单核细胞增生李斯特菌 抑菌处理条件的优化研究

通过模拟鲜切果蔬的低温储藏温度、PH值环境，以及芜菁子挥发油提取物应用于鲜切果蔬保鲜的处理方式，进行芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌抑菌处理条件的优化研究，为芜菁子挥发油提取物的综合利用提供参考依据。在培养温度、处理时间、培养基PH值三种因素三个单因素试验基础上，利用正交试验优化得到芜菁体挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌最佳抑菌处理条件：培养温度10℃、处理时间25min，培养基PH值5，该抑菌处理条件下芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的MIC为0.0056%。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,IM)是主要食源性致病菌之一,可以引起严重的李斯特菌病.日益受到人们的重视,各种快速检测技术也迅速发展.综述了在单增李斯特菌检测时基于常规培养、分子生物学、免疫学和传感器的快速检测技术,并进行了探讨.     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及可溶性分析

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化。根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带。连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21(DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA。IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性。PCR扩增的hlyA基因全长约1 600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60 kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式。成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白。     

TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。     

新疆绵羊致病株李氏杆菌种型鉴定与分析

采用生化反应、溶血试验、致病力试验和PCR方法对分离的新疆5株绵羊致病株李氏杆菌90SB1、90SB2、90SB5、90SS1和125SL进行了种的鉴别测定,并用RAPD技术对这5株李氏杆菌及标准株李氏杆菌进行了初步分型。结果表明,5株绵羊致病株(野毒株)在生化反应、培养特性、溶血性、致病性及溶血素基因特异性等方面表现高度的一致性,属于同一种LM。RAPD实验表明这5株LM指纹图谱相同,属于同一个型。而且其致病性LM与标准LM对照株(从食品中分离到)指纹图谱差异显著,属于不同型。     

单核细胞增生性李斯特菌mpl基因的克隆及其原核表达载体的构建

研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建.通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体.经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为1...     

环介导等温扩增技术的引物设计与筛选研究

[目的]研究引物设计与非特异扩增之间的关系.[方法]以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特异性基因hlyA与沙门氏菌（Salmonella）的特异基因invA为例设计引物,进行环介导等温扩增.[结果]就环介导等温扩增的任何2条引物而言,如果2条引物3’端的3～4碱基在同一条引物上都有2个互补序列,在常用的LAMP反应体系与反应条件下,必然有非特异性扩增,LAMP引物设计与筛选应避免这种情况出现.[结论]按照该试验的原则设计引物,可降低非特异性扩增.     

嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测

从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。     

我国耐喹诺酮类嗜水气单胞菌毒力基因及耐药基因检出情况的系统评价

【目的】了解我国耐喹诺酮类致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因及引起耐药基因的突变情况,为致病性嗜水气单胞菌的防治及毒力基因和耐喹诺酮类药物机制的研究提供参考依据。【方法】通过计算机检索中国知网(CNKI)数据库、万方数据库、维普(VIP)中文科技期刊数据库、读秀知识库等,检索时限均从建库至2016年4月,查找收集有关嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制研究及其毒力基因、致病机理的相关文献,采用Cochrane协作网发布的RevMan 5.3进行常规Meta分析,以加拿大卫生药品技术总署编写的ITC软件进行间接比较Meta分析。【结果】最终纳入31篇文献,其中有19篇检测了致病菌株的毒力基因,含457株菌株;11篇检测了致病菌株的耐药基因,共101株菌株;8篇检测了耐药菌株的耐药基因突变位点,共88株菌株。我国致病性嗜水气单胞菌毒力基因的检出率为:astA基因91.30%、altA基因80.42%、aerA基因72.77%、hlyA基因66.85%、actA基因62.13%、ahpA基因56.18%、ahaI基因53.04%。淮河以北地区主要以hlyA基因为主,检出率(67.31%)显著高于淮河以南地区(P<0.05,下同),且高于全国平均检出率;淮河以南地区主要以actA基因为主,检出率(93.59%)显著高于淮河以北地区,也高于全国平均检出率。质粒介导的耐药基因检出率为:qnrB基因50.00%、qepA基因32.00%、qnrS基因27.91%、qnrA基因6.98%、qnrC和qnrD基因未检出。 gyrA83位点单突变检出率显著高于gyrA83、parC87双位点突变检出率[OR=0.49,95% CI(0.08,3.09),P=0.008]。【结论】我国致病性嗜水气单胞菌的分子检测方法为:淮河以南地区以毒力基因actA和aerA为致病性强的判断标准,淮河以北地区以毒力基因hlyA和aerA为致病性强的判断标准。目前我国耐喹诺酮类嗜水气单胞菌的基因突变位点主要是gyrA83单位点突变和gyrA83、parC87双位点突变。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。