猪肺炎支原体P97基因特异性随机肽库的构建与初步筛选

构建猪肺炎支原体(Mhp)P97基因特异性随机肽库,探索从中筛选Mhp抗原表位的可行性.PCR扩增获得Mhp P97基因的部分C-端序列,产物用DNase Ⅰ消化后将回收的P97随机片段(50 bp～100bp)克隆到pC89pⅧ型噬菌粒裁体中,转化XL1-blue感受态细胞,辅助噬菌体VCSM13超感染,获得MhpP...     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)B细胞抗原表位,本研究将IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白作为免疫原,交叉免疫BALB/c小鼠,制备了1株抗IBV N蛋白的单克隆抗体(MAb)6D10。Westernblot结果表明该MAb可特异性的识别IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株和重组N蛋白。同时利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白抗原表位进行筛选,获得11个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这11个克隆均展示有"FGPRTK"6个氨基酸的序列,对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸残基。同时,通过人工合成其编码序列并进行原核表达,利用MAb6D10对表达产物进行western blot分析,反应性良好。由此表明"FGPRTK"6肽为IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株的一个线性B细胞抗原表位。表位的保守性分析结果表明,本研究鉴定的表位在各种血清型IBV毒株中均高度保守。本研究结果为进一步研究IBV N蛋白抗原的结构和功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选与鉴定

筛选日本乙型脑炎病毒（JEV）的E抗原表位,为开展用JEV模拟表位探索JEV的防治研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据。以抗JEvE蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体7肽库,挑取噬菌体单克隆培养并ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEVE抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽（GGADSMSMAGMAVSY）cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达载体,诱导表达重组多肽并west-ernblot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行Western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多抗。应用上述方法成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为下一步研究奠定了基础。     

猪肺炎支原体P46基因特异性噬菌体随机肽库的构建

通过构建猪肺炎支原体膜蛋白P46的噬菌体展示肽库,以筛选其特异性抗原表位。用DNase I随机消化法获取P46基因主要抗原序列(不含信号肽的编码序列)的随机片段,片段经与pBamHI Linker连接和BamHI酶切后,克隆到pC89 pⅧ型噬菌粒载体,重组噬菌粒转化感受态细胞XL1-Blue,辅助噬菌体VCSM13超感染,从而构建了P46基因特异性噬菌体随机肽库。结果,所建肽库含有约2.3×104个不同克隆,滴度约为1.3×1014PFU/mL。说明所建肽库具有较大库容和较好的多样性,可满足P46蛋白抗原表位的筛选。     

H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原表位的筛选及其抗原性分析

本研究旨在对H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原分子的模拟表位进行分离鉴定并分析其抗原性。用抗H1N1猪流感病毒血凝素蛋白小鼠血清IgG对噬菌体随机12肽库进行筛选,3轮亲和筛选后,特异性噬菌体得到了有效富集;对随机挑选的47个噬菌体克隆用ELISA进行鉴定,其中40个为阳性;对40个阳性克隆测序得到3种不同氨基酸序列;用Western blotting对获得的3个不同序列的噬菌体克隆进行抗原性分析,显示这3种噬菌体插入短肽能和H1N1猪流感病毒感染小鼠血清特异性结合。结果表明,本试验获得了3种H1N1猪流感病毒血凝素蛋白模拟抗原表位,它们都具有明显的抗原性,为H1N1猪流感病毒的疫苗研究和诊断奠定了基础。     

1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为⁸⁴M～K¹⁴²;噬菌体淘选试验结果表明,¹¹⁶TSSFETLFE¹²⁴为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

为了研制一种能够高效表达猪流行性腹泻病毒S1主要抗原表位基因的新型疫苗,将S1主要抗原表位基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建了重组质粒pPICZαC-S1,对重组质粒经Sac Ⅰ酶切线性化后通过电转化法转化到毕赤酵母X-33中,经Zeocin^TM抗性筛选后得到阳性转化子(pPICZαC-S1),转化子接种培养基后用甲醇进行诱导,并对诱导结果进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定。结果表明,纤突蛋白主要抗原表位在毕赤酵母中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为42 ku,且能够与PEDV阳性血清特异性结合。     

应用CSFV-E2基因噬菌体肽库筛选猪瘟病毒抗原表位

采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位.运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多肽进行ELISA反应.经鉴定分析发现单抗WH303从SM-E2库中筛选得到一段CSFV特异的抗原多肽IECTAVSPTTLRTEVVKT,并且该段多肽与已知CSFV表位TAVSPTTLR极为相似;单抗WH211和M56未能筛选到包含CSFV序列的克隆.结果表明,利用靶基因噬菌体随机多肽库筛选抗原表位能够得到更接近于真实表位的抗原表位.     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。     

猪肺炎支原体168株P97基因的克隆与表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P97基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体168弱毒株特异性黏附因子P97抗原决定簇基因部分序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pET-32a,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS-PAGE进行鉴定,Western blot证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件。     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定

【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0～14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0～7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1 000、1∶2 ...     

噬菌体肽库技术筛选抗PRRSV肽及其应用

噬菌体展示肽库是一种被广泛用于抗原表位鉴定,结合蛋白筛选的技术。该试验利用噬菌体展示技术筛选与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）ORF1B复制酶蛋白相互作用的蛋白,并进一步验证筛选蛋白的抗病毒作用。以表达纯化的PRRSV ORF1B蛋白CTD包被高亲和性96孔板作为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对随机12肽库cDNA文库进行筛选,并分析测序筛选的克隆。将筛选出的克隆序列合成后,在体外验证合成多肽的抗PRRSV效果。结果表明,在4轮的噬菌体筛选后,共得到87个阳性克隆,经测序鉴定出11个筛选的12肽,并通过体外抗病毒试验得到P10是一个具有高抗病毒活性的12肽。试验结果为PRRSV的抗病毒研究奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。     

猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建

为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼VHH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×107,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。     

犬吉氏巴贝斯虫BgTRAP的原核表达及抗原表位分析

为表达犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白及鉴定其抗原表位,本研究将犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP编码基因的密码子进行优化和高效表达,并利用生物学软件分析预测,结果显示,Bg TRAP中存在10个潜在的线性抗原表位,通过原核表达系统对其预测表位的多肽进行表达,以筛选的阳性血清样品为检测抗体进行ELISA检测,结果表明其中3个多肽能够与抗体特异性结合,其多肽序列分别为126DYVIAVEDTTHFGE139、672AYILAGFA GLLLIT685和497SDELGDEMGLTTNE510。本研究对Bg TRAP蛋白抗原表位的鉴定,为进一步开发基于Bg TRAP的犬吉氏巴贝斯虫诊断抗原及Bg TRAP的免疫学特性研究奠定了基础。