骆驼天然单域重链抗体库的构建与鉴定

构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因库,并分析其库容量及多样性。结果表明,经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与莱克多巴胺人工抗原特异性结合的噬菌体展示纳米抗体。构建的骆驼天然重链单域抗体库的库容量为107,多样性良好,独立克隆所占比例为90%,筛选出针对莱克多巴胺人工抗原的噬菌体颗粒。已成功构建骆驼天然噬菌体重链抗体库,并筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和莱克多巴胺的免疫学检测奠定基础,并为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

抗磺胺二甲氧嘧啶VHH抗体噬菌体库的构建和鉴定

旨在制备抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)驼源单域重链(VHH)抗体,用于检测动物源性食品中SDM的残留。采用重氮化法,SDM分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原(SDM-BSA)和包被抗原(SDM-OVA)。用SDM-BSA免疫骆驼,在第5次免疫后1周采集骆驼外周血液,分离外周血淋巴细胞,提取RNA,RT-PCR扩增VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,构建双峰驼单域重链抗体库。经本实验室前期测定其库容为1.08×10⁵ CFU,阳性率为96.6%。利用噬菌体展示技术经过4轮生物淘选,筛选获得特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体。结果:构建了SDM的驼源VHH抗体库,经生物淘选及phage ELISA检测获得了特异性的重组噬菌体。通过4轮生物淘选,获得了能够与SDM-OVA抗原有明显结合力且能够特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体,为后期检测SDM在动物源性食品残留奠定了良好的基础。     

新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定

旨在筛选新城疫病毒(NDV)F蛋白的纳米抗体,并对筛选的抗体活性进行初步鉴定。以NDV F蛋白中和表位构建诱饵,利用酵母双杂交技术对双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库进行筛选,获得4株VHH抗体序列。挑选其中2株最符合VHH特征的进行原核表达与纯化,并对2株VHH活性进行鉴定。ELISA结果显示,VHH1与VHH2与NDV病毒的反应性显著高于阴性对照(P0.05),表明VHH与NDV病毒反应活性良好;Western blot结果显示,2株VHH可特异性识别F蛋白;细胞中和试验结果表明,2株VHH抗体均具有一定的中和活性。以上结果提示本研究成功筛选出2株活性较好的抗NDV F蛋白的VHH抗体,为VHH在NDV防控中的应用奠定了基础。     

利用酵母随机展示技术对猪肺炎支原体P97上B细胞表位的筛选和鉴定

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

牛Ⅰ型干扰素受体α链与其配体结合活性的鉴定

为研究牛Ⅰ型干扰素受体α链(IFNAR1)与其配体结合的生物学性质,本研究采用RT-PCR方法从感染水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的犊牛原代肾细胞中扩增得到IFNAR1基因,然后构建了表达BoIFNAR1胞外区多肽(BoIFNAR1-EC)的原核表达载体pET30a-BoIFNAR1-EC,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达出重组蛋白rBoIFNAR1-EC,并以纯化后的rBoIFNAR1-EC作为免疫原制备兔抗牛IFNAR1的多克隆抗体,随后鉴定BoIFNAR1与其配体的结合活性。结果表明,试验成功克隆得到1 685bp的牛IFNAR1基因,编码560个氨基酸,由24个氨基酸组成的信号肽、414个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区及99个氨基酸组成的胞内区组成,与其他物种IFNAR1氨基酸序列同源性为63%~91%,在进化上具有高度保守性,其与羊的亲缘关系最近。随后构建了含牛IFNAR1胞外区基因的重组表达载体,并诱导表达了重组牛IFNAR1胞外区蛋白rBoIFNAR1-EC,其在大肠杆菌中几乎全部为可溶性表达,经纯化透析后作为免疫原制备了兔抗牛IFNAR1的特异性抗体,抗体效价高达1∶204 800。配体结合试验表明,牛IFNAR1重组蛋白可与牛IFN-αA和IFN-ε结合,其多克隆抗体可阻断牛IFN-αA和IFN-ε与细胞表面的IFNAR1特异性结合,进而阻断牛IFN-αA和IFN-ε的抗病毒信号传导。     

Bovine FcgammaRIII with a single extracellular domain

The full length of gene encoding Fc receptor types III for bovine immunoglobulin G (boFcgammaRIII, CD16) was obtained with PCR from the c DNA library of bovine alveolar macrophages. Through molecular cloning and sequencing it is shown that the coding gene has 507 bp and codes for 168 amino acids. There are signal peptide, transmembrane spanning domain and three potential N-linked glycosylation sites in the sequence. Compared with the boFcgammaRIII cDNA sequence cloned by Collins et al, it deletes 82 amino acids and has only one extracellular domain. It is suggested that this cDNA fragment is a special form of the gene structure of bovine FcgammaRIIIA (CD16-II).     

顶复门原虫含苹果结构域蛋白的研究进展

苹果结构域在弓形虫和艾美耳球虫中的研究较深入,其不但具有高度的保守性而且在虫体粘附和入侵宿主的过程中起着重要作用。为此,本文对苹果结构域的结构和功能,及其在弓形虫、艾美耳球虫、肉孢子虫中的研究进展做以综述,以期为开发新一代顶复门原虫的抗虫药物和重组疫苗奠定理论基础[1]。     

资本勾画乳业新版图

1乳业的竞争,归根到底是资本的竞争2002年可谓是中国乳业市场硝烟四起的一年,最吸引眼球的莫过于:光明乳业(600597)成功登陆A股市场。伊利股份(600887)增发5000万A股成功。新希望(000876)欲发8亿元可转债,并在各地马不停蹄地收购11家乳业企业。国外资本进入蒙牛乳业。2002年8月     

猪传染性胃肠炎病毒特异性受体APN 功能区的初步鉴定

试验为了构建猪氨肽酶N（pAPN）不同基因片段大小的重组质粒并进行原核表达及纯化,经Western—blot、ELISA方法初步鉴定猪氨肽酶N受体功能区。试验构建重组了质粒pET30a—pAPN1（106～669nt）、pET30a—pAPN2（670-1044 nt）、pET30a—pAPN3（1045-1773nt）、pET30a—pAPN4（1774～2328 nt）、pET30a—pAPN5（2329—2889 nt）、pET30a—pAPN6（106—1044nt）、pET30a—pAPN7（1774—2889 nt）;转化宿主菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导表达蛋白,包涵体经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳回收纯化;用Western—blot、ELISA方法经抗pAPN多克隆抗体初步筛选出pAPN受体功能区。结果表明：pET30a—pAPN2、pET30a—pAPN3、pET30a—pAPN6、pET30a—pAPN7蛋白均以包涵体形式表达并纯化。pET30a—pAPN3、pET30a-6、pET30a-7能与抗pAPN多抗产生特异性反应。经抗pAPN多抗筛选初步鉴定出其主要抗原功能区在36—153aa、349—591aa、592～963aa内。     

捻转血矛线虫Hc38保守结构域的表达及对绵羊的免疫保护试验

构建捻转血矛线虫Hc38保守结构域原核表达重组质粒pPROEXHTa-Hc38,在DH5a中经诱导表达约17ku的蛋白,表达产物通过Westem blot鉴定,然后将其产物纯化,复性后制备油佐剂疫苗免疫4月龄绵羊,结果表明：对照组与实验组比较,虽然雌虫数量未见减少,但两者荷虫量差异显著（P〈0．05）。     

基因敲除和RNAi在畜牧兽医领域的研究及展望

进入21世纪,生命科学已经进入后基因组时代,大规模的基因功能研究正成为生命科学研究的热点,基因组技术的重要性也越来越明显。论述了基因敲除和RNA干涉两方面技术,并对其在畜牧兽医领域的应用进行了展望,提出了利用基因敲除和RNA干涉技术,能够更清楚地研究和发现基因新的功能,同时还可以用于制备疾病动物模型,用于科学研究和新药的筛选,为畜牧兽医带来广大的前景。     

The C-terminal variable domain of LigB from Leptospira mediates binding to fibronectin

Adhesion through microbial surface components that recognize adhesive matrix molecules is an essential step in infection for most pathogenic bacteria. In this study, we report that LigB interacts with fibronectin (Fn) through its variable region. A possible role for LigB in bacterial attachment to host cells during the course of infection is supported by the following observations: (i) binding of the variable region of LigB to Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells in a dose-dependent manner reduces the adhesion of Leptospira, (ii) inhibition of leptospiral attachment to Fn by the variable region of LigB, and (iii) decrease in binding of the variable region of LigB to the MDCK cells in the presence of Fn. Furthermore, we found a significant reduction in binding of the variable region of LigB to Fn using small interfering RNA (siRNA). Finally, the isothermal titration calorimetric results confirmed the interaction between the variable region of LigB and Fn. This is the first report to demonstrate that LigB binds to MDCK cells. In addition, the reduction of Fn expression in the MDCK cells, by siRNA, reduced the binding of LigB. Taken together, the data from the present study showed that LigB is a Fn-binding protein of pathogenic Leptospira spp. and may play a pivotal role in Leptospira-host interaction during the initial stage of infection.     

鸡Oct-1 POU结构域基因的克隆、表达及纯化

根据GenBank已发表的鸡Oct-1基因序列(M29972)设计一对引物,利用RT-PCR技术从SPF鸡肝脏中扩增出编码Oct-1POU功能域的cD-NA序列,序列比较表明,与GenBank中发表的鸡Oct-1基因的同源性为99.6%,推导的氨基酸的同源性为99%。构建了原核表达载体pET-POU,利用IPTG在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行了纯化,结果表明,Oct-1POU功能域在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,融合蛋白的分子量约为37kD,表达产物经His.Bind亲和层析得到纯化的蛋白。     

Time domain characteristics of hoof-ground interaction at the onset of stance phase

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Little is known about the interaction of the hoof with the ground at the onset of stance phase although is it widely believed that high power collisions are involved in the aetiopathology of several conditions causing lameness. OBJECTIVES: To answer 3 questions regarding the fundamental nature of hoof-ground collision: (1) is the collision process deterministic for ground surfaces that present a consistent mechanical interface (2) do collision forces act on the hoof in a small or large range of directions and (3) Is the hoof decelerated to near-zero velocity by the initial deceleration peak following ground contact? METHODS: Hoof acceleration during the onset of stance phase was recorded using biaxial accelerometry for horses trotting on a tarmac surface and on a sand surface. Characteristics of the collision process were identified both from vector plots and time series representations of hoof acceleration, velocity and displacement. RESULTS: The response of the hoof to collision with smooth tarmac was predominantly deterministic and consistent with the response of a spring-damper system following shock excitation. The response to collision with sand was predominantly random. The deceleration peak following ground contact did not decelerate the hoof to near-zero velocity on tarmac but appeared to on sand. On both surfaces, collision forces acted on the hoof in a wide range of directions. CONCLUSIONS: The study suggests the presence of stiff, viscoelastic structures within the foot that may act as shock absorbers isolating the limb from large collision forces. POTENTIAL RELEVANCE: The study indicates objectives for future in vivo and in vitro research into the shock absorbing mechanism within the equine foot; and the effects of shoe type and track surface properties on the collision forces experienced during locomotion. Studies of this nature should help to establish a link between musculoskeletal injury, hoof function and hoof-ground interaction if, indeed, one exists.