抗磺胺二甲氧嘧啶VHH抗体噬菌体库的构建和鉴定

旨在制备抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)驼源单域重链(VHH)抗体,用于检测动物源性食品中SDM的残留。采用重氮化法,SDM分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原(SDM-BSA)和包被抗原(SDM-OVA)。用SDM-BSA免疫骆驼,在第5次免疫后1周采集骆驼外周血液,分离外周血淋巴细胞,提取RNA,RT-PCR扩增VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,构建双峰驼单域重链抗体库。经本实验室前期测定其库容为1.08×10⁵ CFU,阳性率为96.6%。利用噬菌体展示技术经过4轮生物淘选,筛选获得特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体。结果:构建了SDM的驼源VHH抗体库,经生物淘选及phage ELISA检测获得了特异性的重组噬菌体。通过4轮生物淘选,获得了能够与SDM-OVA抗原有明显结合力且能够特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体,为后期检测SDM在动物源性食品残留奠定了良好的基础。     

双峰驼天然单域抗体库的构建及鉴定

重链抗体的可变区VHH是目前天然存在的具有完整功能的最小抗体分子片段,该抗体在基础研究、药物开发等领域应用前景极为广阔。为了构建双峰驼天然单域抗体库并对其进行初步鉴定,从5峰未经免疫的健康骆驼全血中分离淋巴细胞,提取其总RNA,之后反转录为cDNA,利用PCR技术扩增全套编码重链抗体可变区的基因序列,将经过回收并酶切纯化的VHH序列克隆到噬菌体载体上,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,共转化343次。结果表明,构建的双峰驼天然单域抗体库库容为4.4×10~7,转化阳性率为75%,多样性良好,体现为CDR3区碱基序列及长度存在显著差异。成功地构建了双峰驼天然单域抗体库,为今后从中筛选出具有应用价值的特异性单域抗体奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10~9 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒（CDV）的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1：25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10⁹ PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选（英文）

从未经主动免疫的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,将轻链和重链可变区基因经重叠延伸拼接PCR反应,构建成单链抗体(ScFv)基因。将ScFv基因克隆到噬菌体载体PCANTAB-5E,转化入大肠杆菌TG1中,筛选出阳性克隆,接种于LB培养基,经辅助噬菌体M13KO7拯救,构建天然鼠源噬菌体抗体库,并进行抗体库滴度测定,通过DNA finger printing技术及单链抗体基因序列分析鉴定抗体库的多样性。以堆型艾美耳球虫裂殖子为靶抗原,对构建的噬菌体抗体库进行亲和筛选,将强阳性重组噬菌体克隆感染大肠杆菌HB2151,经IPTG诱导表达可溶性ScFv抗体,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,用ELISA法鉴定其对堆型艾美耳球虫裂殖子抗原的结合活性。结果表明,天然鼠源噬菌体抗体库成功构建,库容量约为2.50×10~(11) CFU/mol,单链抗体库具有一定的多样性。经过4轮亲和筛选,携带抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子表面抗原的特异性噬菌体抗体得到了富集。特异性ScFv抗体在E.coli中分泌表达,表达产物具有免疫活性。筛选出5个与鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗原结合活性较高的克隆,构建的单链噬菌体抗体库的有效表位具有多样性。本研究为进一步认识鸡球虫的各个发育阶段奠定理论基础,为鸡球虫病免疫控制研究提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

抗牛结核分枝杆菌VHH抗体T7噬菌体库的构建与筛选

为获得抗牛结核分枝杆菌的VHH纳米抗体,本研究利用牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫双峰驼,免疫效价达到1∶8 000后采外周血分离淋巴细胞,提取RNA反转录成cDNA,利用巢式PCR方法扩增出编码单域抗体VHH的400 bp基因片段。将目的片段用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,与T7噬菌体载体臂T7Select 10-3RI Arms连接,再通过体外重新包装含目的片段的噬菌体。对建立的VHH噬菌体抗体库进行鉴定,原始文库库容为5.7×10~8 PFU,库阳性率为85.7%。通过4轮生物亲和淘选,筛选并表达出2株高特异性的VHH抗体,均对牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白具有特异性。本研究为进一步探讨VHH抗体在牛结核病的诊断和治疗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型特异性纳米抗体文库的构建及鉴定

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)特异性纳米抗体文库,并对其库容和多样性进行鉴定分析,使用PCV2全病毒灭活疫苗免疫羊驼,经四次免疫后采血分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,通过RT-PCR反转录合成cDNA;根据羊驼重链抗体基因序列设计特异性引物,通过巢式PCR扩增羊驼单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因片段vhh,并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,构建pCANTAB- vhh重组质粒;通过电穿孔法将重组质粒导入E. coli TG1获得抗PCV2特异性纳米抗体基因文库。文库菌梯度稀释后计数单克隆菌落数,并通过菌液PCR鉴定重组菌阳性率,计算抗体文库库容量;对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,分析抗体文库多样性。结果显示,构建的PCV2特异性纳米抗体文库重组菌阳性率为92.0%,库容量为2.75×10¹⁰ CFU/mL;测序后序列比对分析结果表明,纳米抗体文库包含的基因序列具有丰富的多样性。本研究成功构建了PCV2特异性纳米抗体文库,且文库质量满足后续试验要求,为进一步获得针对PCV2抗原的纳米抗体奠定了基础。     

IBRV特异性噬菌体单域抗体库的构建、筛选及鉴定

为了开发有效的用于治疗和诊断牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的抗体,试验用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)免疫双峰驼,构建IBRV特异性噬菌体单域抗体库,并以IBRV gD蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明:构建得到的IBRV特异性噬菌体单域抗体库的库容为7×10~7;经3轮富集和筛选,phage-ELISA筛选出14个与gD蛋白结合的阳性克隆,并成功对阳性值较高的重组单域抗体IB68进行表达和纯化;经ELISA和Western-blot鉴定,重组单域抗体IB68可与gD蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的IBRV特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原抗体结合活性和免疫学反应性。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。     

鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库的构建

利用雄鼠脾细胞免疫6~7周龄C57BL/6雌鼠,加强免疫后取脾细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,并逆转录合成cDNA第一条链。以其为模板,利用特异性Ig基因的引物PCR扩增出重链Fd片段和κ链基因,并将扩增出基因重组到噬质粒载体pComb3中,重组噬质粒转化大肠杆菌XL1-Blue中,分别构建κ链基因库和抗体Fab段基因库。分别经蓝白斑筛选,计算转化效率,通过PCR反应和双酶切反应鉴定抗体库的重组率,轻链、重链Fd段基因的重组率均为80%。抗体Fab段基因库经过辅助噬菌体VCSM13超感染,成功构建了鼠源性噬菌体Fab抗体库,并测定噬菌体抗体库的库容和滴度,结果分别为1.5×107,3.2×1011pfu/mL。对噬菌体抗体库的18个克隆进行ELISA分析,结果显示以雄鼠脾细胞作为抗原时,有9个克隆含有雄性特异性的噬菌体抗体,而以雄鼠睾丸细胞作为抗原时,有8个克隆与睾丸细胞呈现结合活性。噬菌体抗体库的构建为雄性特异性抗原的鼠源性噬菌体抗体Fab片段的筛选及其应用、雄性特异性抗原和抗体功能性分子基础的研究奠定了坚实基础。     

新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定

旨在筛选新城疫病毒(NDV)F蛋白的纳米抗体,并对筛选的抗体活性进行初步鉴定。以NDV F蛋白中和表位构建诱饵,利用酵母双杂交技术对双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库进行筛选,获得4株VHH抗体序列。挑选其中2株最符合VHH特征的进行原核表达与纯化,并对2株VHH活性进行鉴定。ELISA结果显示,VHH1与VHH2与NDV病毒的反应性显著高于阴性对照(P0.05),表明VHH与NDV病毒反应活性良好;Western blot结果显示,2株VHH可特异性识别F蛋白;细胞中和试验结果表明,2株VHH抗体均具有一定的中和活性。以上结果提示本研究成功筛选出2株活性较好的抗NDV F蛋白的VHH抗体,为VHH在NDV防控中的应用奠定了基础。     

欧洲鳗鲡T7噬菌体单链抗体库的构建、淘选及其在大肠杆菌中的高效表达

为构建欧洲鳗鲡噬菌体天然单链抗体(scFv)库,筛选鳗鲡病原菌特异性scFv,本研究采用PCR扩增健康欧洲鳗鲡重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增完整的scFv基因(VH-Linker-VL)序列,与T7噬菌体载体连接,经体外包装后接种于宿主菌BLT5403,增殖后经PCR扩增获得噬菌体scFv库。进而以嗜水气单胞菌重组外膜蛋白为抗原,对噬菌体scFv库进行4轮生物淘洗,采用阻断ELISA选取抗体活性最高的scFv,构建pGEX-4T-2-OMP-scFv重组表达载体,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。结果显示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此构建的噬菌体scFv原始库容为1.26×10~6pfu,经扩增后初级库滴度为2.8×10~9pfu/mL;淘洗获得的嗜水气单胞菌重组外膜蛋白scFv抑制率最高达到81.7%,并实现了该scFv在大肠杆菌中的表达,SDS-PAGE检测其蛋白分子量约为53 ku。本研究构建的欧洲鳗鲡噬菌体天然scFv库及淘选获得的特异性嗜水气单胞菌scFv,为养殖鳗鲡病原菌的检测与免疫防治奠定了基础。     

抗庆大霉素噬菌体抗体库的构建和筛选

本研究使用噬菌体抗体库技术筛选针对庆大霉素（gentamicin）的单链抗体。以抗庆大霉素杂交瘤细胞株（2A3）为基因来源构建scFv基因,连接至pCANTAB5E噬菌粒载体,通过电击转化TG1（Escherichia coli TG1）构建了库容量为6.5×106噬菌体单链抗体库。抗庆大霉素噬菌体单链抗体库进行三轮富集筛选,通过Phage-ELISA技术成功筛选出了9个抗庆大霉素噬菌体阳性克隆,为开发新型残留检测用抗体奠定了基础。     

禽流感免疫噬菌体抗体库构建及ELISA检测方法的建立

本研究应用噬菌体抗体库技术筛选禽流感亚型病毒Fab抗体,并建立相应ELISA检测方法。用禽流感亚型混合疫苗免疫小鼠,取其脾脏提取总RNA用于扩增免疫球蛋白轻链和重链基因,克隆至噬菌粒pComb3,然后转化入感受态细胞XL1-Blue中,以10¹² CFU辅助噬菌体VCSM13进行感染后,获得Fab抗体库容量为8×10⁷ CFU。以H5N1病毒为抗原进行4轮亲和筛选,获得特异性结合的克隆,利用获得的特异性克隆进行ELISA检测方法的建立。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。