短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

成都市郊区土壤芽孢杆菌的解磷、解钾潜力

采用稀释平板法对成都市郊区27个土壤样品进行了芽孢杆菌的分离,获得333个菌株。在解磷、解钾培养基上分析其解磷、解钾能力。结果表明,约有15%的土壤芽孢杆菌菌株分解无机磷的效果显著,分属15种芽孢杆菌,其中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)为分解无机磷的优势芽孢杆菌。多数菌株也能在有机磷和钾细菌培养基上生长,但分解能力较差。     

基于MALDI-TOF-MS质谱技术对蜂蜜中芽孢杆菌的鉴定与分型

[目的]对分离自不同产地和品种的蜂蜜中的芽孢杆菌属进行鉴定分型,探索利用蜂蜜中芽孢杆菌特征指纹图谱对蜂蜜产地和品种进行溯源的可行性。[方法]从44种不同产地和品种蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌,3株铜绿假单胞菌。采用基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)条件对分离的芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。[结果]44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,短小芽孢杆菌(B.pumilus)5株,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)3株,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)2株,炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)1株,土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri.)2株。通过多次重复试验,表明从同一份样品或同一品牌蜂蜜样品中能稳定分离到芽孢杆菌,获得的蛋白指纹图谱具有极好的稳定性。[结论]MALDI-TOF-MS可根据获得的芽孢杆菌蛋白指纹图谱将芽孢杆菌划分为不同类型,可作为一种新的根据蜂蜜中芽孢杆菌的特征指纹图谱进行溯源的方法。     

草本纤维提取用菌株的PCR-16S rDNA及ITS-RFLP分析

通过分析从沤麻水中分离到的8株草本纤维提取用菌株的16S rDNA以及ITS序列,鉴定并构建其聚类图,明确草本纤维提取用菌株的遗传关系.通过BLAST比对16S rDNA并用限制性内切酶酶切16～23S的ITS保守序列,对参试菌株的16S rDNA及ITS酶切片段进行聚类分析.结果表明,8株菌株分别属于地表芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌:基于16S rDNA序列与ITS-RFLP所获得的聚类结果基本一致,菌株1251与菌株1172-1聚为一类,其余聚为一类,但种内聚类存在一定的差异,可能与不同类型的序列进化程度有关,8株菌株的16SrDNA序列的相似性为78.66%;Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Taq Ⅰ 4种限制性内切酶对参试的8株草本纤维提取用产芽孢菌株的ITS进行酶切,各获得0～4条100～440bp的酶切产物.     

多功能芽孢杆菌的分离、筛选及活性测定

从小麦、禾本科杂草根际取样,分离固氮芽孢杆菌,并测定各菌株的抑菌活性及降解有机磷农药的能力,筛选多功能芽孢杆菌菌株.结果表明,分离筛选的11株固氮芽孢杆菌主要包括胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus);其中7株菌株对立枯丝核菌和禾谷丝核菌两种病原菌具有明显的抑菌活性;5株菌株能有效降解甲胺磷和甲基对硫磷两种有机磷农药.巨大芽孢杆菌BM3和地衣芽孢杆菌BL6具有明显的固氮、抑菌和降解有机磷农药等多种功能活性.     

GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探

以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子。对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达。     

枯草芽孢杆菌MN菌株由来胶原蛋白酶的纯化与生化性质

从传统小麦粉发酵食品中分离得到一株革兰氏阳性且为兼性需氧的内生芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌MN菌株,该菌能产生胶原蛋白酶,其16S核糖体核酸序列与枯草芽孢杆菌显示99%的同源性.通过一系列的离子交换层析与分子筛层析,该菌分泌产生的胶原蛋白酶被分离纯化到单一条带,通过分子筛层析预测该胶原蛋白酶的分子量为33 kDa,其活性最适反应温度与酸碱度分别为55℃和pH 11.0,而且该酶的热稳定性与酸碱度稳定性分别为50℃和pH5.0～11.0.     

枯草芽胞杆菌果糖基转移酶基因的克隆及其序列分析

利用自行设计的引物,在枯草芽孢杆菌基因组内获得果糖基转移酶基因,基因和相应蛋白序列分析发现.该基因共1 422个碱基,编码473个氨基酸,与GenBank注册的sacB基因序列有89%的相似性;全长序列有152突变碱基,共造成18个氨基酸的错义突变,但没引起酶保守活性位点的关键氨基酸突变.这结果为后期表达特异连接α1→2糖苷键的果糖基转移酶或者该基因的定点突变打下基础.     

枯草芽孢杆菌启动子序列在大肠杆菌中的克隆及序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌的P43启动子基因序列,设计合成了一对引物.用PCR方法钓取枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的启动子基冈,PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后,连接到pMD18T-simple载体上,进行序列测定.测序结果表明:枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的启动子全长427 bp,由两个叠加的启动元件组成,分别为σ55和σ37RNA聚合酶识别的位点.与GenBank中的其他序列比较发现核苷酸的同源性为99.5%,氨基酸的同源性为98.6%,说明枯草杆菌P43启动子的基因序列高度保守.     

柿树根际嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20的分离鉴定

采用CAS检测平板法,从柿树根际土壤中分离获得一株具有较强产嗜铁素能力的细菌菌株CAS20。根据菌株在LB固体培养基上的培养特征和生理生化特性,将其初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus);经16S rDNA序列分析,CAS20的16S rDNA基因序列(KY199559)与地衣芽孢杆菌(Bacillus.licheniformis)代表菌株ATCC14580的16S rDNA序列(NR_074923)具有99.93%的相似性,并且位于系统进化树的同一分枝。据此,将菌株CAS20鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

餐厨垃圾中胶原蛋白和几丁质原位降解菌株的筛选与鉴定

从餐厨垃圾、畜肉市场和屠宰场等处采样,采用平板透明圈法和猪皮消化试验初筛胶原蛋白降解菌,采用平板透明圈法和虾壳消化试验初筛几丁质降解菌,通过测定发酵液胶原蛋白酶和几丁质酶活性复筛菌株,对目标菌进行形态学、生理生化和16S r DNA序列鉴定,并用该菌室外原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾。分离到11株高效降解胶原蛋白的菌株,其中的B3和C3具有较高的几丁质酶活,并能有效消化虾壳;B3的胶原蛋白酶活性和C3差异不显著(P0.05),而几丁质酶活性显著比C3高(P0.05)。B3被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌室外原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾2 d,降解效果达到24.78%,比对照高15.74百分点。     

高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌的筛选及glsA基因的克隆

为筛选获得高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌菌株,提高谷氨酸的含量,试验通过康维皿弥散法对525株芽孢杆菌进行酶活检测,获得一株产谷氨酰胺酶活力为68.407 mg NH3/(g曲·h·37℃)的B.subtilis GA317菌株,其酶活力较B.subtilis BJ3-2高5.59倍.对2个菌株谷氨酰胺酶编码基因glsA...     

黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选及鉴定

通过48孔板微培养的方法对336株芽孢杆菌菌株进行黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选,获得14株能在以香豆素作为惟一碳氮源的培养基中生长的芽孢杆菌菌株。在投料浓度为100μg/kg条件下,对这14株芽孢杆菌进行复筛,获得1株黄曲霉毒素B1降解率为83.20%的芽孢杆菌菌株。通过16S r DNA序列比对分析,初步确定这株芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

防治人参黑斑病与灰霉病的复合芽孢杆菌制剂

从2个不同的人参栽培基地选取健康无病变的人参植株叶片作为筛选生防菌的材料，应用选择性分离法从人参叶片中分离芽孢菌，经染色鉴定、菌落形态鉴定、显微形态鉴定及基因序列分析，筛选出286株芽孢菌，其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)4种菌为优势菌种；制备复合芽孢杆菌制剂，4个菌种的菌株比例n(枯草芽孢杆菌)∶n(特基拉芽孢杆菌)∶n(贝莱斯芽孢杆菌)∶n(地衣芽孢杆菌)约为100∶60∶70∶40;分别用4种优势菌与复合芽孢杆菌制剂做平板，进行对峙拮抗试验，分析4种优势菌与复合芽孢杆菌对人参黑斑病和灰霉病防治效果。结果表明：4种芽孢杆菌及复合芽孢杆菌对黑斑病病原菌均有不同程度的抑制作用。复合芽孢杆菌抑制效果优于单一使用的其中任何一种，复合芽孢杆菌对黑斑病菌、灰霉病菌病原菌的抑制率分别为89.74%、82.26%。用复合芽孢杆菌进行田间试验，复合芽孢杆菌对黑斑病与灰霉病的总体防治效果为65.1%,与代森锰锌总体效果比较无显著性差异；虽然不如...     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达.结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA...     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及活性测定

以日本纳豆、重庆江津豆豉、忠县豆腐乳为原料,采用酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛,得到18株产溶栓酶的菌株.通过纤维蛋白平板实验,从忠县豆腐乳中筛选出1株具有较高溶栓活性的菌株FR-033(登录号:HQ009804),菌株经液体发酵后获得含酶发酵液,采用硫酸铵分段盐析及sephadexG-50凝胶层析进行纯化,获得较高纯度的溶栓酶,酶活力为2 163 IU/mL.进一步对FR-033菌株的形态和生理生化特征进行研究.利用细菌16S rDNA通用引物对16S rRNA进行PCR扩增并测序,得到1444 bp长度的DNA序列,通过BLAST软件在NCBI网站收索其同源性性序列,利用PAUP4.0和MAGE4软件绘制系统发育树,结果表明:菌株FR-033与枯草芽孢杆菌(Bacil-lus subtilis)的16S rRNA序列同源性达99%以上,在系统发育树中,菌株FR-033与枯草芽孢杆菌在同一支上,且遗传距离最短;FR-033的形态及大部分生理生化特征与枯草芽孢杆菌极为相似,表明该菌株是枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis)的一个高效的产溶栓酶菌株.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01转座突变株的构建及转化体系的优化

Tn5转座子及其衍生载体被广泛应用于革兰氏阴性菌的基因功能研究,但尚未见有利用Tn5转座子导入革兰氏阳性菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01菌株的报道.本研究通过构建Tn5转座载体,对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的突变株.同时,考察了感受态细胞培养浓度、电击电压、电...