枯草芽孢杆菌rocG基因插入失活突变株的构建

枯草芽孢杆菌中有2个编码谷氨酸脱氢酶(GDH)的基因:rocG基因和gudB基因。其中Bacillus subtilis 168菌株的rocG基因编码有活性的GDH,而gudB基因编码没有活性的GDH。敲除168菌株的rocG基因后,gudB基因会自发突变为gudB1基因,后者编码有活性的GDH(gudB1-GDH)。为了研究gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制,构建了pMUTin4-rocG插入突变重组质粒,将其转化至B.subtilis 168,成功获得了1株rocG失活突变株BS-△rocG。对BS-△rocG和野生株的生长情况及GDH酶活进行了比较,发现BS-△rocG生长情况和野生株相当,但其GDH酶活为4.641U/mg蛋白,高于野生株的3.042U/mg蛋白。由此推测BS-△rocG中,gudB可能自发突变为gudB1,从而能够编码有活性的GDH,这一结果为研究枯草芽孢杆菌gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制奠定了基础。     

高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定

以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋向酶高产菌株.先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌.测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U·mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定.     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因敲除载体的构建

rocG基因和ure基因分别编码纳豆芽孢杆菌中2个与产氨相关的酶--谷氨酸脱氢酶编码和尿素酶。为构建这2个基因的敲除载体,通过PCR分别获得了2个靶基因的上下游旁邻片段和抗性筛选基因nisI。将上游旁邻片段、nisI和下游旁邻片段按次序克隆到革兰氏阳性菌基因组整合质粒pMUTIN4中。限制性内切酶酶切图谱分析及测序结果显示成功构建了纳豆芽孢杆菌rocG基因和ut＇e基因的敲除载体pMUTIN4-rocG：nisI和pMUTIN4-“M：：nisI。该质粒的构建,为同源重组获得低产氨纳豆芽孢杆菌工程菌株奠定了基础。     

产青霉素G酰化酶工程菌的构建

【目的】构建表达巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶(PGA)的枯草芽孢杆菌工程菌.【方法】首先采用PCR从巨大芽孢杆菌基因组DNA中扩增出长度为2 409bp的PGA编码基因,经琼脂糖凝胶电泳检测及DNA测序验证后,再将其与枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PMA5(7.5kb)连接后导入到枯草芽孢杆菌10397中表达,并通过聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)检验其能否表达.【结果】构建了9.9kb大小的PMA5-PGA重组质粒,经SDS-PAGE验证,青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌10 397中作出表达.基因工程菌在37℃、220r/min培养36h发酵条件下,所产PGA的酶活可达到12.426U/mL,比巨大芽孢杆菌发酵产PGA酶提高了5.26倍.【结论】所构建的枯草芽孢杆菌是青霉素G酰化酶的高产工程菌.     

β-甘露聚糖酶基因高效表达体系的构建

为构建-β甘露聚糖酶基因高效表达体系,采用重叠区扩增基因拼接法将苏云金芽孢杆菌(Bacil-lus thuringiensis)CTc S-层蛋白启动子和欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)CXJZ95-198 β-甘露聚糖酶基因完整开放阅读框定向连接,得到基因拼接体slp-man.将 slp-man 克隆到高效表达载体 pET-28a+上,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中.结果表明,β-甘露聚糖酶基因高效表达体系构建成功,重组茵发酵11 h酶活达到671.3 U·mL-1,是欧文氏杆菌CXJZ95-198的1.48倍.     

纳豆芽孢杆菌和发头裸腹潘对污水的净化效果

分别用发头裸腹溞(1 mL污水中加0.1个发头裸腹溞)、纳豆芽孢杆菌(1 mL污水中加1.0×105个纳豆芽孢杆菌)和发头裸腹潘+纳豆芽孢杆菌(1 mL污水中加0.1个发头裸腹溞和1.0×105个纳豆芽孢杆菌)处理里下河污水,以不加发头裸腹潘和纳豆芽孢杆菌的里下河污水为对照.结果表明:纳豆芽孢杆菌处理污水72 h,污水的COD从开始的15.98 mg/L下降到8.44 mg/L;各处理对污水总氮有一定的去除效果,对氨态氮、总磷去除效果不明显.     

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

中性β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。     

Expression of a Lysine-rich Gene in Bacillus subtilis 168

Lysine-rich protein gene (lys) was cloned from winged bean (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC), and cloned into prokaryotic expression vector pHT43, the recombinant plasmid pHT43/lys were constructed and then transferred into Bacillus subtilis168, upon IPTG induction, the recombinant protein was expressed, and the content of lysine was detected by HPLC. The result showed that lysine content increased by 9.85%. It was suggested that introducing lys gene into Bacillus subtilis 168 was an effective way to improve its nutrition quality.     

纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选

分别从北京、大连和日本三个产地的纳豆食品中分离纯化得到了9个具有纳豆芽孢杆菌典型菌落特征的芽孢杆菌单菌落,与模式菌株纳豆芽孢杆菌N1株分别从菌落形态、个体形态和生理生化试验三方面进行对比鉴定,结果表明,其中5株芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌。将这5株纳豆芽孢杆菌分别在酪素平板上划线初选,得到了298株具有蛋白酶活力的菌株,从中筛选出活性最高的5株命名为:NB、NC、ND、NE和NF,测定各株发酵液的纳豆激酶酶活力,结果表明NB、NC和ND3株具有较高纳豆激酶活性,酶活力分别达到了1041.37、1125.13和1804.64IU·mL-1。     

枯草芽孢杆菌突变株proBA基因植物表达载体的构建及转基因拟南芥的耐盐性能初探

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)抗脯氨酸结构类似物突变株中克隆得到脯氨酸合成途径中的关键酶基因proB(编码γ-谷氨酰胺激酶)和proA(编码谷氨酰胺-γ-半醛脱氢酶),同时设计引物从拟南芥基因组中扩增得到吡咯啉-5-羧酸合成酶B基因(p5csB)的第一个内含子序列,将其分别与proB和proA基因通过PCR拼接后,酶切连接构建得到植物双元表达载体pBI121pro.以LBA4404为介导,采用真空抽滤的方法转化得到转proBA基因拟南芥;第三代的纯合子(T3)通过半巢式PCR的方法验证外源基因已整合到拟南芥基因组中,GUS活性分析表明外源基因在叶片中表达最强,茎部其次,根部最弱;对600 mmol·L-1致死浓度NaCl耐受能力的分析表明,转基因拟南芥的平均存活时间(37.8 min)明显高于野生型拟南芥(26 min).     

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。     

高温中性蛋白酶基因的克隆、表达及验证研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶基因进行了克隆、测序及表达研究.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得特异性片段.经测序分析,其具有一个942 bp的蛋白酶完整阅读框.通过表达载体构建,获得质粒pPL-tnp,并转化至蛋白酶缺失受体菌枯草芽孢杆菌AB97013,经表达验证其蛋白酶最适作用温度和pH与出发菌相符.证明研究获得了高温中性蛋白酶基因及表达质粒pPL-tnp,并正确表达.     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其在烟草中的表达

利用PCR克隆了大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),构建了含betB基因的重组植物表达质粒载体pLM47,并用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草叶片进行遗传转化。结果表明,在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获得基因转化烟草植株3株;经报告基因GVS的组织化学检测和Western blot检测,证明betB基因在烟草转化植株中得到了表达。     

应激诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中表达

克隆含有信号肽碱性木聚糖酶基因(xynA)片段与依赖转录起始因子σB的启动子PgsiB片段,将其克隆至实验室前期构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体上,并转化入枯草芽孢杆菌WB700菌株,获得重组菌BXS-W.当细菌生长至对数期中期时,施加不同的应激处理,采用DNS法测定木聚糖酶活性.结果显示,获得了xynA与PgsiB片段;成功构建表达载体pBXS,并获得重组菌株BXS-W;应激试验表明,施加的5种应激条件均极显著提高(P＜0.01)木聚糖酶基因的表达量,其中以乙醇应激效果最好.     

来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究

漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cotA基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta（DE3）菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白CotA的最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5 μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005 μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活（557.8 U/mg）是低温诱导法（0.2 U/mg）的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。