欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

用PCR的方法从甘露聚糖酶高产菌欧文氏杆菌CXJZ95-198中克隆到甘露聚糖酶基因manA全长以及其N端缺失81、111、141 bp的片段,连接到pET28a载体再转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用透明圈法鉴定其酶活性.结果表明,删除了manA N端111 bp的翻译产物依然具有酶活性,删除了N端141 bp的翻译产物无酶活性,manA N端111～141 be可能具有重要意义.     

欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

用PCR的方法从甘露聚糖酶高产菌欧文氏杆菌CXJZ95-198中克隆到甘露聚糖酶基因manA全长以及其N端缺失81、111、141 bp的片段,连接到pET28a载体再转入大肠杆菌BL21（DE3）中,用透明圈法鉴定其酶活性。结果表明,删除了manA N端111 bp的翻译产物依然具有酶活性,删除了N端141 bp的翻译产物无酶活性,manA N端111～141 bp可能具有重要意义。     

转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠的制备

为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功.     

CXJZ95-198菌株β-甘露聚糖酶的纯化条件研究

研究通过超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀及凝胶层析等纯化步骤,将CXJZ95-198菌株所分泌的β-甘露聚糖酶进行了纯化,其纯化倍数为12.05,收率为33.50;.通过SDS-聚丙烯酰胺电泳得到单一条带蛋白,分子量为52.29 kD.     

β-甘露聚糖酶基因的克隆及原核表达载体的构建

目的:克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体。方法:提取地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组,PCR法扩增该菌基因组中的β-甘露聚糖酶基因,与表达载体p ET-28a连接并转化到E.coli BL21中,构建原核表达载体,并对阳性重组菌进行PCR和酶切鉴定。结果:成功克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体,β-甘露聚糖酶基因全长1008bp,编码336个氨基酸,蛋白质分子量约为38KDa。SDS-PAGE检测显示重组酶分子量约为38KDa。结论:成功构建β-甘露聚糖酶基因的原核表达载体为基因的重组表达奠定基础。     

里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建

将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒p^GEM-ManI经EcoRI、绿豆芽核酸酶、HindⅢ酶切处理和纯化后，与含有Ω序列和17启动子以及信号肽OmpT序列的分泌型表达载体p^TCO2连接，将质粒p^GEM-ManI中的β-甘露聚糖酶基因连接在p^TCO2质粒信号肽OmpT之后，构建成表达载体p^TCO2-ManI。将表达载体p^TCO2-ManI转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，克隆转化子，pCR测序，结果获得了β-甘露聚糖酶编码的成熟肽cDNA，其序列与GeneBank报道完全一样。并从该克隆转化的大肠杆菌的周质中检测到了β-甘露聚糖酶的活性同时，证明β-甘露聚糖酶基因在分泌型过程中得到正确加工。     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展

β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸、洗涤等工业领域应用广泛。近几年,基因测序技术飞跃发展,研究人员挖掘到许多新颖的β-甘露聚糖酶基因并对其进行了酶学性质的研究。介绍了各种类型的甘露聚糖及其降解酶,梳理了β-甘露聚糖酶的糖苷水解酶家族分类、来源、结构和催化机理,归纳总结了近几年微生物来源β-甘露聚糖酶的重组表达、酶学性质及分子改造,简述了甘露聚糖酶在食品和饲料等方面的应用,展望了β-甘露聚糖酶的研究热点及方向。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增β-甘露聚糖酶基因编码序列．经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员，该基因已往册GenBank．将该基因克隆到原核表达载体pRSET—A中并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3）pLysS，经过诱导获得了此酶的高效表达．其表达量达到37．78U／mL。酶学特性分析表明其作用的最适pH为5．0．最适温度为60℃．     

地衣芽孢杆菌W10 β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达

地衣芽孢杆菌W10菌株具有较高的β-甘露聚糖酶活性。采用PCR技术从W10基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因序列,通过克隆、测序获得1 017 bp甘露聚糖酶基因manW10,其编码338个氨基酸。以pET-22b(+)为载体和pelB为信号肽,将manW10转入EscherichiacoliBL21(DE3)中进行表达,经IPTG诱导酶活性达19.73 U.mL-1。经镍柱亲和层析获得较纯的β-甘露聚糖酶,其分子质量约为38 ku。     

来源于链霉菌Streptomyces fradiae var.k11的抗蛋白酶甘露聚糖酶的基因克隆与鉴定

通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var.k11中克隆得到一个β-1,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽.构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL21(DE3),特异性表达manS221基因,重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化.酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0～9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性.这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景.     

黑曲霉MAN1基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

为了通过基因工程的方法在大肠杆菌中生产β-甘露聚糖酶.以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过RT-PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN1的cDNA片段,将该片段克隆连至pMD18-T并测序.Blast比对结果表明,该序列与GenBank中编号XM001400053的序列相似性为100％,将pMD18-MAN1与PE...     

新型高产β-胡萝卜素巴斯德毕赤酵母表达宿主菌的构建

分泌型巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为高效表达宿主菌已被广泛应用,通过高密度培养工艺用于多种酶制剂(如植酸酶、甘露聚糖酶等)的规模生产。然而,在生产过程中产生的大量菌体利用率低,多数被废弃掩埋,或只能作为廉价的菌体蛋白,造成大量的资源浪费。为提高酵母发酵副产物的利用率,向毕赤酵母宿主菌GS115中导入来源于红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）β-胡萝卜素合成途径中的关键基因(idi、crtE、crtYB和crtI),获得了胞内高产β-胡萝卜素的工程菌株P. pastoris GS115-CARO,实现工业生产中的菌体蛋白的高附加值利用。同时以来源于嗜热篮状菌（Talaromyces leycettanus JCM12802）的甘露聚糖酶基因Man5T作为参照,验证了宿主菌P. pastoris GS115和P. pastoris GS115-CARO在表达外源蛋白的差异。结果表明：Man5T基因的导入并没有影响,两株宿主菌的甘露聚糖酶表达量（分别为280 U/mL和286 U/mL,P>005）,但宿主菌P. pastoris GS115-CARO胞内β-胡萝卜素产量高达到31.27 mg/g(菌体干重dry cell weight,dcw)。构建的工程菌株不仅可以实现外源酶制剂的高效表达,有效地提升酵母菌体资源的利用价值,同时也在一定程度上了解决了发酵菌体对环境的污染问题。     

β-甘露聚糖酶基因重组整合组成型表达载体的构建

应用PCR方法从P.pastorisGS115染色体中扩增了GAP启动子(PGAP),大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的AOX1启动子(PAOX1),构建了组成型表达载体pGAP;再从野生型酵母菌JSY4染色体中扩增出25S rDNA保守序列,大小为1 700bp左右,以其取代组成型表达pGAP上的组氨酸脱氢酶基因(H IS4)片断,构建了整合组成型表达载体pGAP-rDNA。再双酶切重组质粒pT002M anⅠ得编码β-甘露聚糖酶的ManⅠ基因片断插入pGAP-rDNA的多克隆位点(MCS),获得含有目的基因ManⅠ的重组整合组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ。CaC l2法转化感受态大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行质粒PCR鉴定和单、双酶切鉴定。结果表明:成功构建了重组组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ,为下一步野生型酵母菌JSY4中β-甘露聚糖酶的组成型表达打下基础。     

欧文氏杆菌CXJZ11-01基因组文库的构建

采用改良鸟枪法构建了草本纤维精制高效菌种CXJZ11-01的基因组文库,通过透明圈法筛选到了2个木聚糖酶基因阳性克隆.     

一种来源于Paenibacillus sp. A1的中性β-甘露 聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究

采用简并PCR和TAIL-PCR技术,从来源于天山冰川土壤的类芽孢杆菌Paenibacillus sp. A1菌株基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列。序列分析表明,该基因全长960 bp,编码一个新的糖苷水解酶第5家族的β-甘露聚糖酶。将该基因克隆到原核表达载pET-22b(+)中,经过IPTG诱导表达,酶的胞外表达量达0.62 U/mL。酶学特性分析表明其最适pH为6.5,最适温度为55℃,属中性β-甘露聚糖酶,具有较好的底物适应性,适宜用于鱼类等水产动物养殖饲料行业中。     

甘露聚糖酶man23基因的重组及其在短短芽孢杆菌中的表达

为了提高甘露聚糖酶Man23的表达量,降低它的体外降解程度,将其基因连接到质粒pHY-p43上,由强启动子p43启动基因man23的表达.将构建的重组质粒pHY-p43-man23转化至短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中,经转化的B,brevis发酵后的上清液中酶活高达22480 U.mL-1,较出发菌株Bacillus subtilis B23所产生的甘露聚糖酶活力提高了26.7%.B.brevis体系的表达产物经SDS-PAGE检测,其图谱比出发菌株表达产物的更为明晰,目的蛋白带更宽,带色更深,说明目的酶的产量得到了大幅提高,表达产物得到了明显纯化.试验表明以p43为启动子,B.brevis为表达质粒的宿主菌,不仅保证了基因产物的分泌和正确折叠,而且实现了基因的高表达和产物的高活力.     

甘露聚糖酶基因3'端缺失研究

[目的]初步研究甘露聚糖酶基因3’端对甘露聚糖酶功能的重要性。[方法]以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。[结果]删除甘露聚糖酶基因3’端246bp后甘露聚糖酶依然具有酶活性。[结论]甘露聚糖酶基因3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

文心兰NPR1基因的克隆与诱导抗性过程中的表达分析

【目的】探明文心兰NPR1基因在诱导抗性过程中的生理作用。【方法】利用RACE技术克隆文心兰NPR1基因全长,并进行相关生物信息学分析和遗传进化树的构建;以印度梨形孢共培养、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理文心兰,分析菊欧文氏杆菌导致的软腐病抗性影响及NPR1基因的表达特性变化。【结果】克隆得到的2条基因序列长度分别为1 804 bp和1 902 bp,编码555、556个氨基酸,均为NPR1类型,分别命名为OgNPR1-1和OgNPR1-2;文心兰两个NPR1基因在未接菌的情况下均呈现低表达量,在接种共生菌印度梨形孢后轻微上调表达,在接种菊欧文氏杆菌后显著上调表达,而在印度梨形孢共生菌的存在下,接种菊欧文氏杆菌使两个NPR1基因表达更为活跃;同时,相比印度梨形孢共生菌处理,两个NPR1基因均在外源SA、MeJA处理下接种菊欧文氏杆菌表现为更显著上调表达;此外,共生印度梨形孢可显著提高文心兰对菊欧文氏杆菌导致软腐病的抗性,限制软腐病病症在非接病叶片的扩展。【结论】在共生印度梨形孢的文心兰植株中,印度梨形孢显著提高了文心兰NPR1基因响应菊欧文氏杆菌的表达水平,虽然上调水平不及SA和MeJA激素处理的水平,却使文心兰植株表现出更强的对抗软腐病的能力。     

来源于链霉菌Streptomyces fradiae var. k11的抗蛋白酶甘露聚糖酶的克隆

通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var. k11中克隆得到一个β-l,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1 359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽。构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL2l（DE3）,特异性表达manS221基因, 重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0~9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性。这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景。