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3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。 相似文献
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毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究 总被引:2,自引:0,他引:2
香豆酸-3-羟基化酶(C3H)是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H.PheC3H基因全长1 842 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白(PheC3H),C端具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。相似性比对显示, PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。 相似文献
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飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1 天至第7 天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37-50℃,最适pH为8.0-9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200 μmol•L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60 μmol•L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200 μmol•L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43 μmol•L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶(GlcNAc kinase)补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc6P),用于几丁质的合成。 相似文献
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EgrGATL1(Eucgr.I01882)是巨桉Eucalyptus grandis糖基转移酶GT8家族中GATL子类GATL-a子组的成员,多参与细胞壁组分如果胶、木聚糖等的生物合成。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析表明:EgrGATL1在木质部和韧皮部的相对表达量较高;不同低温(-8,-4,0,4,8℃)和4℃不同时间(0,2,6,12,24,48 h)处理对EgrGATL1都有强烈诱导作用。4℃不同时间处理下,EgrGATL1基因共表达产物主要参与代谢途径分析数据库(KEGG)中的糖代谢和氨基酸代谢途径。干旱胁迫对EgrGATL1有诱导作用;100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理对EgrGATL1表达呈现瞬时诱导效应;200 mmol·L-1氯化钠(NaCl)和100 μmol·L-1脱落酸(ABA)对其表达有抑制作用,而且随处理时间延长,2种处理对EgrGATL1的抑制规律有很强同步性。这些结果说明:EgrGATL1有可能通过参与细胞壁组分生物合成和ABA等植物生长调节剂活性调控,在巨桉低温、干旱和高盐等非生物逆境响应过程中发挥一定作用。 相似文献
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为获得稳定的聚合酶链式反应(PCR)产物,采用正交设计L25(56)对光皮桦Betula luminifera表达序列标签一简单重复序列聚合酶链式反应(EST-SSR PCR)反应体系中的5个因素:DNA模板浓度,引物浓度,镁离子(Mg2+)浓度.三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明:光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系:4.0mg·L-1DNA模板,0.500μmol·L-1引物,1.250mmol·L-1Mg2+,0.250mm01·L-1dNTPs.0.0725×16.67mkat·L-1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST—SSRPCR反应体系进行稳定性检测.结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15 相似文献
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指天蕉β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析 总被引:2,自引:1,他引:1
【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1, 3-葡聚糖酶基因,为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因,据其保守区域设计一对简并引物,通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp,其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中,与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高(71%)。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物转基因抗病育种研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因(Bactrocera dorsalis 14-3-3,Bdor 14-3-3),研究Bdor 14-3-3 mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor 14-3-3;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头(去除触角)和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28 和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor 14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor 14-3-3可能发挥着重要作用。 相似文献
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为深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及功能,将该酶基因克隆到表达载体中,转入大肠杆菌中诱导表达,表达产物经monomeric avidin-Sepharose亲和层析分离纯化,获得了纯的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶.结果表明:纯化后的草酰乙酸脱羧酶经SDS-PAGE检测,呈现3条蛋白谱带,相对分子质量分别为65×103、46×103、8.8×103左右;该酶不耐高温,50 ℃温浴1 h后活力几乎完全丧失;其最适pH为6.0左右;1 mmol·L-1Zn2+、0.5 mmol·L-1草酸和20 mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力,10~20 mmol·L-1NaCl对该酶有明显激活作用,但200~500 mmol·L-1的NaCl对该酶却有明显抑制作用. 相似文献
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长末端重复序列(LTR)反转录转座子广泛存在于植物基因组中,本质是一段可移动的脱氧核糖核酸(DNA)序列。大多数LTR反转录转座子在外界环境变化下能够被激活转录,对环境变化做出响应。为研究毛竹基因组中的LTR反转录转座子的转录活性及在非生物环境胁迫下表达量的具体变化,克隆和鉴定了1个毛竹Phyllostachys edulis反转录转座子PHRE7。该转座子全长为6 073 bp,属于Ty1-copia家族中的Tork分支,LTR序列相似性为96.7%,插入时间为126.923万a前。对毛竹实生苗分别进行辐照(30,50,70 Gy),甲基化抑制剂(50,100,150 μmol·L-1),高温(42℃),低温(4℃),高盐(0.1,0.2,0.3 mol·L-1)等5种不同胁迫处理,通过定量荧光聚合酶链式反应(PCR)检测,PHRE7在INT,RT和RH等3个结构域中的表达量仅在辐照及0.2~0.3 mol·L-1高盐处理下随处理强度的上升而下降,其余所有处理(甲基化抑制剂、高温、低温、高盐0.1~0.2 mol·L-1)的表达量都随处理强度呈上升趋势。这些结果表明:PHRE7转座子是一个具有转录活性的LTR反转录转座子,且外界非生物环境胁迫对其表达模式有较大影响,表明PHRE7转座子能够响应外界环境变化。 相似文献
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从野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)中PCR克隆得到删除信号肽的纤维素酶基因engXCAΔSP,并成功使用CPEC(circular polymerase extension cloning)方法构建了原核表达载体pET28a-engXCAΔSP;将该载体转入大肠杆菌rosetta(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质的表达;通过Ni-NTA树脂非变性亲和纯化到了较纯的蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明:engXCAΔSP基因编码出约50 kD的蛋白质ENGXCAΔSP。然后对该酶成功进行了固定化。该酶比活为60 U.mg-1,固定前后最适温度为53℃与62℃,最适pH为5.4与5.8,动力学常数分别为Vmax:411μmol.mL-1.h-1与383μmol.mL-1.h-1,Km:0.2500%与0.3125%。 相似文献
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竹林施肥是集约经营毛竹Phyllostachys edulis林提高经济效益的重要手段之一。为了确定毛竹林氮素的合理施肥量, 从2006-2011年持续调查了氮素施肥对毛竹竹笋和竹材产量的影响, 在2011年测定了施肥对毛竹光合色素和光合作用的影响。结果表明:100, 250和400 kg·hm-2施肥水平均能显著促进毛竹冬笋、春笋和竹材产量提高以及新竹胸径增大, 其中在250 kg·hm-2施肥水平时, 各平均值分别比对照提高了6.8倍(P < 0.01), 2.0倍(P < 0.01), 1.1倍(P < 0.01)和33.3%(P < 0.01), 但是250和400 kg·hm-2施肥水平之间无明显差异。氮素施肥后, 1年生和3年生毛竹叶片的光合色素质量分数、光饱和点、净光合速率均明显提高, 而光补偿点和胞间二氧化碳摩尔分数则明显降低。这表明植株的光合能力明显提高, 其中以250 kg·hm-2施肥效果最明显。综合分析试验结果, 毛竹林施肥量以250 kg·hm-2为宜。 相似文献
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【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。 相似文献
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酵母乙醇提取物是利用啤酒干酵母经培养发酵后提取的富含多种活性物质的混合物。初步实验研究发现,该物质对大肠杆菌蛋白表达有明显促进作用。为了进一步研究其对蛋白表达的作用,以E.coli BL21(DE3)/p GEX-4t-1-ggt为主要研究菌,以2 g·L-1乳糖作为诱导剂,研究酵母乙醇提取物对γ-GGT蛋白表达的作用。研究发现,分批添加终浓度10 g·L-1的酵母提纯提取物到2 g·L-1的乳糖为诱导剂的培养基中可以显著提高γ-GGT蛋白的表达及宿主菌的生长,蛋白表达量比1 mmol·L-1 IPTG诱导效果高10%~50%,菌体密度提高1.75~3倍左右。对于其他的重组蛋白及表达宿主有相似的作用。酵母乙醇提取物与乳糖组成的复合制剂可以有效替代有毒性的IPTG作为诱导剂的使用,为大规模诱导蛋白表达奠定了基础。 相似文献
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采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础. 相似文献