利用RACE方法克隆小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA

【目的】研究小麦抗条锈菌的分子机制,在受条锈菌侵染的非亲和组合小麦叶片中克隆一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA。【方法】采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE),在感染小麦条锈菌的小麦(水源11)叶片中进行-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的扩增。【结果】得到了一个1338 bp-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,Genbank上注册号为DQ090946,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与-β1,3-葡聚糖酶基因gi3757681和gi6782375的同源性分别为94.3%和92.1%。该全长cDNA具有完整的编码框,编码334个氨基酸,Genbank上注册号为AAY96422,与-β1,3-葡聚糖酶CAA77085和AAA32958的同源性分别为95.8%和86.7%。【结论】初步推断此全长cDNA是小麦中编码-β1,3-葡聚糖酶的一个新基因。     

多粘类芽孢杆菌CP7β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及应用

【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,经体外消化后黏度降低了4.69%(P﹥0.05)。【结论】β-1,3-1,4-葡聚糖酶是CP7菌发酵液中抗真菌活性组分或其中之一,对真菌生长抑制的活性作用提示其可作为农业抗病虫害新型药物进行开发研究;该酶能够有效降低麦类饲料黏度,表明其作为饲料添加剂的开发利用同样具有良好前景。     

植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因研究进展

植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因在植物生长发育过程中扮演重要角色。近年来,随着分子生物学的不断发展,对其研究也取得了重要进展。综述了植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、功能、表达调控以及编码蛋白质的结构、底物等方面的研究进展,可为进一步阐明该基因对植物生长发育的影响提供依据。     

条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

望江南中核糖体失活蛋白新基因Cass in I的克隆及特征分析

【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因,为该类蛋白基因功能研究和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1和P2,对药用植物望江南基因组进行PCR扩增,获得一种新的RIP基因片段。通过RACE法,获得了其全长cDNA序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为882bp,其推导的氨基酸序列与葫芦科两个代表核糖体失活蛋白β-luffin和Trichosanthin（TCS）的相似性分别为58.2%和34.7%,与GenBank中其它核糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现：CassinⅠ有9个氨基酸残基与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在P1/P2扩增区段内。【结论】首次在望江南中克隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因,为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠定了基础。     

望江南中核糖体失活蛋白新基因CassinⅠ的克隆及特征分析

【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因,为该类蛋白基因功能研究和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1和P2,对药用植物望江南基因组进行PCR扩增,获得一种新的RIP基因片段。通过RACE法,获得了其全长cDNA序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为882 bp,其推导的氨基酸序列与葫芦科两个代表核糖体失活蛋白β-luffin和Trichosanthin（TCS）的相似性分别为58.2%和34.7%,与GenBank中其它核糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现：CassinⅠ有9个氨基酸残基与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在P1/P2扩增区段内。【结论】首次在望江南中克隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因,为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠定了基础。     

内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性

【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene,eglS）,探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。     

β-1, 3-葡聚糖酶与植物的抗病性

综述了β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病性方面的研究进展。β-1,3-葡聚糖酶在体外抑制病原物的生长;病 原物的侵染诱导植物β-1,3-葡聚糖酶活性升高和产生新的β-1,3-葡聚糖酶同工酶,这些高活性的β-1,3-葡聚糖 酶或特异性的同工酶提高了植物的抗病性;组成型表达β-1,3-葡聚糖酶基因的转基因植物,可有效地抵抗病 原物的侵袭。由于β-1,3-葡聚糖酶和病原菌的多样性及其它们在植物体内分布的不同,使得各种β-1,3-葡聚糖 酶在植物抗病性中的作用也不尽一样。     

β-1,3-葡聚糖酶及其在蔬菜抗真菌病害基因工程中的应用

β-1,3-葡聚糖酶是重要的细胞壁水解酶,可以降解真菌的细胞壁,对植物真菌病害的防治起重要作用。对β-1,3-葡聚糖酶基因进行分离和克隆,并将其转入植物,可成为植物抗真菌病害防治的有效途径之一。文章对β-1,3-葡聚糖酶的分布、分类、结构特点、作用机理及其在蔬菜真菌病害的防治中的应用进行了阐述。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析

[目的]克隆分析香蕉中14-3-3蛋白编码基因。[方法]采用PCR与RACE技术相结合的方法克隆香蕉14-3-3基因,并进行CDNA测序及同源性分析。[结果]所克隆cDNA全长866 bp,编码197个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的特征结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的序列相似性,将其命名为Ma-14-3-3d(Musa acuminate14-3-3gene)。[结论]Ma-14-3-3d蛋白与来源于单子叶植物的14-3-3蛋白位于同一进化枝上。     

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1 110个茶树花蕾cDNA片段中,122个（10.9%）是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因（GenBank登录号：DQ444463）,其全长为1 072 bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

禾谷镰孢菌β2-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

【目的】在大肠杆菌中表达禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的β2-微管蛋白,筛选使β2-微管蛋白可溶性表达的诱导因子,并对可溶性蛋白进行纯化。【方法】以构建好的质粒（pET32a+-β2-tubulin）为模板,PCR扩增出β2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,并转化到表达宿主菌BL21(DE3)及Rossatta（DE3）pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子;对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证。【结果】获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆;为了克服常规诱导条件下表达的β2-微管蛋白主要以包涵体形式存在的问题,通过对诱导温度、时间、诱导物浓度、初始诱导时的菌液浓度、培养液及宿主菌等六因子的综合分析,获得了β2-微管蛋白可溶性表达的优化条件;利用HisTrap HP预装柱对β2-微管蛋白进行纯化,可获得纯度很高的可溶性β2-微管蛋白;SDS-PAGE确认表达出的融合蛋白分子量为51.6 kD;Western blot证实表达的融合蛋白能与6×His及β-微管蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。【结论】本研究为外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达提供了参考;获得的微管蛋白为研究微管蛋白靶标类药物的抗性机制以及生产中开发新的以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。