一种简便的热启动PCR方法扩增金葡菌nuc基因

本文采用低熔点琼脂糖包被Taq酶热启动聚合酶链式反应(PCR)扩增出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因,该法与普通PCR扩增效果无异且具有避免非特应性扩增等特点.同时研究了不同退火温度对扩增反应结果的影响,确定了51.7C为最佳退火温度.为进一步研究热启动PCR方法提供了依据.     

一种简便的热启动PCR方法扩增金荀菌nuc基因

本文采用低熔点琼脂糖包被Taq酶热启动聚合酶链式反应（PCR）扩增出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因,该法与普通PCR扩增效果无异且具有避免非特应性扩增等特点。同时研究了不同退火温度对扩增反应结果的影响,确定了51．7℃为最佳退火温度。为进一步研究热启动PCR方法提供了依据。     

应用PCR-限制性内切酶技术快速检测副结核分枝杆菌

根据副结核分枝杆菌的IS900序列,设计相应的引物,建立检测副结核分枝杆菌的PCR技术。利用该方法,可从副结核分枝杆菌中扩增出PCR产物,扩增产物具有高度特异性,长度为388bp,经限制性内切酶Saμ3AI酶切,证实该扩增产物为副结核分枝杆菌的片段。表明此项技术具有快速、敏感和特异性强等特点,通过PCR扩增IS900基因(副结核分枝杆菌独有的基因),可快速的应用于诊断反刍动物的副结核病和乳及乳制品中副结核分枝杆菌的鉴定。     

PCR-ELISA快速检测高致病性禽流感病毒方法的建立

作者针对H5亚型禽流感病毒的包含多碱性氨基酸裂解点特异性片段，设计特异性引物并从病料中扩增出RT—PCR产物，再以ELISA方法判断PCR扩增的有无。结果表明，本方法具有较高的特异性和敏感性。     

PCR扩增牙釉基因X和Y染色体不同序列鉴定牛早期胚胎性别

本实验利用牛牙釉基因特异性引物扩增牛血液、成纤维细胞和胚胎DNA,旨在优化牛早期胚胎性别鉴定的方法。结果表明:实验利用两温度PCR扩增母牛DNA样品获得1条来自X染色体458 bp产物,PCR扩增公牛DNA样品获得2条产物,其中395 bp扩增产物来自Y染色体,458 bp扩增产物来自X染色体,60头已知性别牛样品鉴定的准确率为100%。实验优化了一种两温度PCR快速鉴别奶牛及其早期胚胎性别的方法。     

PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测     

半套式PCR检测石蜡包埋组织中猪圆环病毒2型方法的探讨

半套式 PCR是采用一对半特异性引物对目的基因进行扩增的一种方法 ,该方法较常规 PCR的更敏感和更特异。本试验即采用该种方法 ,从石蜡包埋组织中提取圆环病毒 DNA进行 PCR扩增 ,来检测猪圆环病毒。结果表明组织石蜡切片经二甲苯脱蜡 ,蛋白酶 K消化 ,利用半套式 PCR方法 ,得到 43 2 bp的特异性扩增产物 ,从而建立了一种新的检测圆环病毒的方法 ,并为从存档石蜡研究该病提供了很好的前景     

H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术

根据GenBank中H5N1亚型流感病毒HA基因保守区的序列,设计1组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系,优化LAMP反应条件,最佳等温扩增反应条件为65℃保温60min。扩增后产物加入核酸染色剂SYBRⅠ和4 mmol/L Mg2+,结果可视。扩增产物可用特异性内切酶KpnⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法一致。RT-LAMP技术整个检测过程只需1~2 h,不需要PCR仪和成像系统,仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验,验证了建立的RT-LAMP技术可以作为一种操作简单,灵敏性、特异性高的检测H5亚型禽流感病毒的方法。     

甘肃玛曲县犬棘球绦虫病流行调查分析

目的:建立检测家犬粪便中细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫DNA的PCR方法,为开展流行病学监测提供检测手段.方法:收集玛曲县牧区家犬111只,收集粪便标本,提取犬粪便DNA,进行PCR技术扩增,扩增产物鉴定.建立犬粪细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫PCR诊断方法,对此诊断方法敏感性和特异性进行鉴定.     

羊痘病毒PCR检测方法的建立和试剂盒的研制

根据GenBank上已发表的羊痘病毒(CPV)的全基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增羊痘病毒的引物,扩增产物大小约为445bp。通过对PCR方法的优化,建立了检测羊痘病毒的PCR方法,并研制出检测试剂盒。同时对试剂盒的敏感性,特异性和稳定性进行了研究。实验结果表明,该试剂盒具有良好的敏感性和特异性,稳定性在-20℃至少可以保存一年。     

饲料中牛羊源性成分的定性检测——定性聚合酶链式反应法(PCR)法

目的:为防止疯牛病和痒病的传播。方法:研究提供了一种利用从动物饲料中提取牛羊动物基因组DNA的方法,并依据牛、羊基因组DNA的特异性序列片段,利用种属特异性的引物,通过PCR扩增这一特定的DNA序列,通过电泳分离PCR产物,以长度的PCR产物作对照。结论:实现了对动物饲料中牛、羊源成分的检测。     

PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因进行胚胎性别鉴定的研究

牙釉蛋白（amelogenin,简写为AML）基因是牙齿发育过程中丰富表达的多拷贝基因,AML基因的同源基因分别定位在XY染色体上。本试验利用x—Y同源的牙釉蛋白基因序列设计一对特异性引物（牛AML基因序列的扩增片段长度：雌性为只有467bp的特异性扩增片段：雄性为同时具有341bp和467bp的两条特异性扩增片段）,应用PCR技术同时扩增X和Y染色体上的特异性片段,扩增产物用PAGE电泳分离技术,经硝酸银溶液染色及扫描分析进行妊娠奶牛早期胚胎的性别鉴定。结果显示,从X染色体上扩增出467bp的片段．从Y染色体上扩增出341bp的特异性片段。由此可知,PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因可以进行胚胎的性别鉴定。     

阿勒泰羊内参基因GAPDH和β-actin实时定量PCR重组质粒标准品的构建

为了研究阿勒泰羊的GAPDH和β-actin基因的实时定量方法,并为其相关功能基因的表达研究提供基础,试验采用荧光实时定量PCR法,克隆绵羊的GAPDH和β-actin部分基因序列,并以常规PCR产物为标准品,建立了标准曲线及熔解曲线。结果表明:标准曲线的相关系数分别为0.999 9和1.000 0,扩增效率分别为96%和109%;熔解曲线峰形锐利,无非特异性杂峰,表明PCR产物单一,无引物二聚体及非特异扩增产物。说明所建立的方法特异性强、相关系数高,可应用于阿勒泰羊的功能基因表达的定量分析研究。     

PCR结合斑点杂交技术在检测禽网状内皮增生病毒中的应用

为评价PCR结合斑点杂交技术在鸡REV检测中的应用价值,采用PCR法制备禽网状内皮细胞增生症病毒特异性地高辛标记DNA探针,同时用PCR技术、斑点杂交方法和PCR产物斑点杂交方法检测了不同地区的病、死鸡的组织样品REV的感染情况。结果表明,PCR产物斑点杂交法的检出率(45.16%,14/31)高于组织DNA直接斑点杂交法(32.26%,10/31),显著高于单纯PCR扩增法(0%,0/31)。PCR结合斑点杂交检测技术能快速、敏感、准确,充分避免PCR中的假阴性和假阳性现象,值得推广应用。     

羊痘病毒PCR快速检测方法研究

针对羊痘病毒(Capripoxvirus,CaPV)的基因组中末端反向重复序列设计、合成1对特异性引物,优化PCR反应体系和扩增条件,建立诊断羊痘病毒的PCR方法。结果表明,山羊痘病毒的PCR产物为289bp,与预期片段大小相符,而羊的健康皮肤扩增物中没有DNA条带。本方法具有快速、灵敏、特异性高的特点,可作为实验室快速诊断羊痘病毒的有效方法。     

原位PCR及其在兽医分子生物技术中的应用

原位 PCR是一种将常规 PCR的高效扩增与原位杂交技术结合起来的新方法 ,其类型主要有直接原位 PCR、间接原位 PCR、原位 RT-PCR和原位再生序列复制反应 ,其中间接原位PCR应用最为广泛。原位 PCR技术的基本步骤包括标本处理、蛋白酶消化、原位 PCR扩增和扩增后产物的检测。原位 PCR技术操作比较复杂 ,同时在操作中易出现假阳性结果和假阴性结果。尽管如此 ,原位 PCR技术作为一种特异性、敏感性高的靶序列定位检测技术 ,作为研究基因信息和细胞、染色体等的形态信息的有力工具 ,在兽医分子生物技术中仍然具有广泛的应用和发展前景     

水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒(AMDV)纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,此纳米PCR的最佳退火温度为51℃,普通PCR为55℃;加入胶体金最佳浓度在0.2~0.8nmol·L-1,纳米PCR与普通PCR产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米PCR方法只扩增AMDV而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米PCR敏感性比普通PCR高10倍。检测40份临床样品,结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高,从而为用粪、尿等低病毒样品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。     

鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的建立与应用

为鸡沙门氏菌的临床检测提供了一种更快速、敏感、特异的诊断,参照GeneBank中已公布的的鸡白痢沙门氏菌fliC基因序列,合成出了一对引物,使用PCR法对1株沙门氏标准菌株和其他3株非沙门氏菌标准菌株进行DNA抽提扩增并检测其敏感度。采用上述技术,对12份可疑病料及10份饲料进行PCR检测,同时与传统检测方法进行比较。结果表明1株沙门氏菌PCR产物出现600 bp的特异性DNA扩增带,而非沙门氏菌均未出现扩增条带,证明所设计引物具有沙门氏菌特异性;通过敏感度检测,此PCR体系能检出50 pg以上的细菌DNA,敏感性较高。运用PCR法阳性检出率及敏感性均高于常规检测方法。由此可见,沙门氏菌PCR检测是一种快速、敏感和高度特异的诊断方法。     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。     

鸡传染支气管炎病毒H52、H120和M41株的PCR鉴别方法研究

根据GenBank发表的序列,对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）H52、H120和M41株全基因组序列进行比较,设计并合成了两对特异性引物,其中一对引物能以M41株为模板,特异性扩增出1791bp的目的片断,从而特异鉴定IBVM41株;另一对引物能以H52株和H120株为模板,特异性扩增1700bp的目的片断,再用限制性内切酶NaeI对PCR产物进行酶切,H120株能够被切成1000bp和700bp两个片段,而H52株的PCR产物不存在该酶切位点,从而能区分H52株和H120株。本研究建立的PCR方法和技术具有快速、简单、特异性强等优点,可用于IBVH52、H120和M41株活疫苗的分子鉴别。