逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。     

H3N8亚型马流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立检测H3N8亚型马流感病毒的RT-LAMP方法,根据H3N8亚型马流感病毒HA基因序列,设计了2对LAMP引物,经过优化反应条件,建立了RT-LAMP检测H3N8亚型马流感病毒方法。结果表明,RT-LAMP方法能够在63℃恒温条件下、75min内实现目的基因片段的大量特异性扩增,通过荧光显色就可直接用肉眼判断结果。对H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒的核酸无交叉反应,具有较好的特异性;方法的灵敏度比常规RT-PCR的高10倍;该方法操作简便快速、省时省力,而且灵敏度高、特异性强,对H3N8亚型马流感病毒的检测具有实际的应用价值。     

H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种H7亚型和N9亚型禽流感病毒(AIV)可视化快速检测方法。根据GenBank中H7亚型和N9亚型AIV HA和NA基因序列,在其保守区域设计筛选出H7亚型和N9亚型AIV的特异性LAMP引物各一套,优化反应条件,建立能检测H7亚型和N9亚型AIV RT-LAMP方法,并进行特异性和敏感性检验。结果显示,该法用实时浊度仪63℃反应1h,能特异性地检测H7亚型和N9亚型AIV,而对其他15个H亚型和8个N亚型的AIV和禽类呼吸道病原体均无扩增,最低能检出10拷贝·μL-1目的基因。所建立的H7亚型和N9亚型RT-LAMP方法特异性强、敏感性高,结果可视化,操作简便、快速,为H7、N9和H7N9亚型AIV的有效防控提供技术支撑,具有较好的应用前景。     

科技动态

利用RT-LAMP快速检测H9亚型禽流感病毒中国农业大学蒋菲等利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,     

H9N2亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立

根据H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因的保守序列,设计2套特异性LAMP引物和2条探针引物,同时在2条探针的5′端分别标记不同的荧光基团,在3′端都标记猝灭基团,然后使用多色荧光成像仪观察反应后是否有荧光产生来判断反应管里是否有阳性扩增,通过荧光颜色的不同来分析阳性扩增产物的类型。特异性试验结果显示该方法能特异性扩增H9亚型和N2亚型AIV,对其他15个HA亚型和其余8个NA亚型AIV以及禽类常见病原体均无扩增;干扰性试验结果显示H9和N2两种亚型AIV可以在同一反应管中独立完成扩增,二者互不干扰;敏感性试验显示其最低检测限度为100拷贝/μL。试验结果表明本试验建立的二重荧光RT-LAMP检测方法具备反应快速、灵敏、特异性强同时可以用肉眼直接观察辨别扩增产物的优点,对H9N2亚型AIV临床快速检测具有较好的应用前景。     

H10亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中H10亚型AIV的HA基因序列,选取特异性序列,设计了6条LAMP引物,用于H10亚型AIV的检测,优化反应条件,建立了H10亚型AIV RT-LAMP可视化检测方法,对该法进行特异性和敏感性验证。结果显示:该法特异性强,只与H10亚型AIV反应,与其他亚型AIV和常见的禽类疾病无交叉反应;灵敏度高,检测下限为100拷贝/μL模板;仪器简单,只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成全部扩增反应;结果可视化,肉眼直接观察结果。结果表明:本试验建立的H10亚型AIV检测方法简便、快速,尤其适合于养殖场和基层工作站的检测,为该病的诊断和防控提供一种有效的方法。     

多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。     

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法的建立

LAMP技术是一种快速新型的核酸检测技术,该技术利用4条引物在恒温下扩增目的 DNA,特异性好敏感性高。本试验旨在建立一种能同时鉴别诊断FMDV和VSV的二重RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每套引物的内引物中插入酶切位置EcoRⅠ,对反应条件进行了优化,建立了恒温快速的检测方法。结果显示:该方法特异性好,能检测到口蹄疫病毒的A,O,Asia1亚型和水泡性口炎的NJ和IND亚型,并与其他对照牛病原体不发生交叉反应;敏感性高,最低能够检测个100个FMDV病毒RNA和100个VSV病毒RNA;干扰性小,能同时检测两个模板的不同浓度组合。本试验建立的口蹄疫和水泡性口炎二重RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。     

B亚型禽偏肺病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

利用Primer Explorer V4在线软件设计针对B亚型禽偏肺病毒(aMPV)F基因的特异性引物,并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件,建立了B亚型aMPV逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法.该方法能够在63℃条件下1h内实现B亚型aMPV F基因片段的特异性扩增,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸无交叉反应.反应结果可直接用肉眼判断.对质粒DNA的最小检测量为1×102拷贝/μL.利用建立的检测方法对20份疑似aMPV样品进行检测,其阳性检出率为10％.结果表明,建立的B亚型aMPV RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点,可应用于相关疾病的临床诊断.     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立和应用

为了研究检测猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,试验采用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)分别设计了6条针对CSFV5′端保守基因特异引物,经条件优化后建立猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法。结果表明:在63℃恒温条件下45 min就能很好地扩增出CSFV目的片段;RT-LAMP产物经XhoⅠ酶切确定产物即为目的片段;将CSFV和其他6株与CSFV同属的病毒进行RT-LAMP扩增,结果只有CSFV得到阳性结果,其他均为阴性,说明此方法的特异性强;RT-LAMP对CSFV的最低检测量为1×101个基因拷贝,是常规RT-PCR敏感度的100倍;用CSFVRT-LAMP法和RT-PCR检测方法分别对27份临床样本进行检测,结果证明CSFV RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果的符合率为92.6%。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR for Detection of H6N1 Subtype Avian Influenza Virus

According to the sequences of HA and NA genes of H6 and N1 subtype avian influenza virus (AIV),two pairs of specific primers and two TaqMan probes with different fluorescence were designed.The duplex Real-time RT-PCR assay was developed and optimized to simultaneously detect H6 and N1 subtypes AIV in one reaction.The result showed that the specificity of this assay was high and only amplified H6 and N1 subtypes AIV,and was not cross-reactive with other H and N subtypes AIV,newcastle disease virus and infectious bronchitis virus.The detection limit of this assay was 100 copies/μL of H6N1 subtype AIV.This newly developed duplex Real-time RT-PCR assay was a rapid,specific and sensitive method for the detection of H6N1 subtype AIV,and it could provid a technical support to prevent and control H6N1 subtype AIV.     

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法.该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL.本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑.