菊花EST-SSR分析及标记开发

为了开发菊花的分子标记,对7 087条菊花EST进行拼接,得到275个contigs,发现50个SSR位点;在拼接的contigs中SSR平均密度为每2 854.3 bp含有1个SSR。三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的50.00%;在二碱基重复中,最主要的优势重复基元是AC和AG;三碱基中CAT和CCA为优势重复基元;四碱基、五碱基重复类型中,(TTTN)n和(ATTTN)n重复基元为对应优势基元;这些优势重复基元中富含碱基A和T,菊花EST序列中高度变异的微卫星(长度>20 bp)约占2.00%。根据得到的菊花EST-SSR,共设计出428对引物,并选取了28对SSR引物对黄山贡菊基因组DNA进行PCR扩增,其中有27对引物扩增成功。     

桑树EST—SSR引物开发

【目的】利用桑科的EST数据库进行桑树EST—SSR引物开发,为丰富桑树SSR数据库提供参考。【方法】下载NCBI中桑科的EST数据库,进行序列处理及拼接后,用SSRIT搜索其中的SSR位点,以Primer Premier 5．0设计引物,选用5个桑树品种各5株样品进行多态性引物筛选。【结果】下载的EST拼接后得到2008条拼接片段（contig）,共搜索到831个SSR位点,分布在799个contig中。二、三核苷酸重复基元是主导类型,分别占总SSR的66．06％和32．37％;TC／AG和CT／GA是二核苷酸优势重复基元,分别占二核苷酸总数的28．64％和25．87％。设计合成77对EST—SSR引物,其中46对能够扩增出有效条带;经多态性筛选,26对引物可扩增出多态性条带。【结论】利用桑属近缘属的EST序列进行桑树EST—SSR引物的开发是可行的;开发出的26对多态性引物可用于桑树遗传多样性分析和种质鉴定等。     

苦荞转录组EST-SSR发掘及多态性分析

利用Misa软件对苦荞种子转录组高通量测序获得的45 699条EST序列进行了SSR位点扫描,共得到2 700个SSR位点,分布于2 624条EST序列中,SSR位点平均距离为1/1.73 kb。随着EST序列长度的增加,含SSR位点序列的比例也随之升高,800 bp以上EST序列含SSR的比例明显高于800 bp以下序列。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复是苦荞EST-SSR主导类型,分别占总SSR的52.11%、13.33%和30.63%,其中(A)n、(AG)n和(AAG)n是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基序,分别占总SSR的51.85%、7.11%和8.93%。设计合成了150对 EST-SSR 引物,其中91对引物（60.67%）在40份苦荞种质中获得有效扩增,30对引物（32.97%）具有多态性。平均每对引物能检测到3.53个等位变异;多态信息含量（PIC）在 0.10~0.71之间,平均达0.40。以上结果说明,从苦荞转录组EST序列中大规模开发SSR标记是一条简便而可行的途径。     

黄鳝EST-SSR标记的开发及其通用性检测

利用SSRrepeat软件对NCBI数据库中黄鳝肠道EST序列进行挖掘、验证,分析微卫星(SSR)在这些序列中的总体分布特点,并开发黄鳝EST-SSR引物。结果显示,在黄鳝肠道的814条EST序列中共搜索到51个SSR位点,分布在43条EST中,出现频率为6.27%。这些EST-SSR的平均长度为18.80 bp。其中,三核苷酸重复为主导类型,占总SSR的49.02%,其次为二核苷酸重复,占29.41%。四、五、六碱基重复序列分别占微卫星总数的3.92%、11.76%、5.88%。多态性引物验证结果表明,在设计合成的21对EST-SSR引物中,12对在黄鳝中获得有效扩增。其中7对引物显示出多态性,共扩增出29个等位基因;每个位点等位基因数为2~7个(平均4.14),观测杂合度(Ho)为0~0.857 1,期望杂合度(He)为0.135 1~0.822 7,多态信息含量(PIC)为0.123 8~0.781 1。在鲤形目和鲈形目中进行的跨物种扩增结果表明,12对引物中有7对引物在5个不同物种间得到成功扩增,5对引物在个别物种间表现出多态。研究获得的EST-SSR引物,可用于黄鳝的种资资源评价及遗传结构研究。     

新疆三个绵羊品种EST-SSR多态性的遗传分析

从国际公共生物数据库检索获得绵羊皮肤组织EST中筛选SSR,搜索到含有SSR的196条EST,共209个SSR位点,占整个绵羊皮肤组织EST数据库的6.3%,其中双碱基重复最多,占总SSR的71.8%,AC/TG重复在双碱基类型中最丰富,占双碱基微卫星序列总数的67%。根据筛选到的SSR设计并合成引物22对,其中18对在中国美利奴羊上有目的扩增条带。选用重复性好、多态性高的5对引物在中国美利奴羊、多浪羊和罗姆尼羊三个群体内进行PCR扩增,共检测到25个等位基因,位点多态信息含量变化范围为0.5030～0.7583,多态信息丰富;三个群体内等位基因类型、频率分布差异较大,发现了半细毛和细毛羊群体特有的3个等位基因;群体聚类结果表明,罗姆尼羊和多浪羊遗传距离最小。     

宽体金线蛭基因组SSR序列特征分析 及其分子标记开发

[目的]分析宽体金线蛭基因组SSR序列特征,并开发多态性SSR分子标记,为宽体金线蛭种质遗传多样性分析及良种选育等提供有效的分子标记.[方法]利用基因组de novo测序技术对宽体金线蛭基因组进行扫描,通过序列拼接得到基因组序列,利用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位点,分析SSR序列特征并使用PRIM-ER3 Input(version 2.3.7)设计引物,随机选择三碱基、四碱基和五碱基SSR分子标记引物50对对8份宽体金线蛭DNA样品进行PCR验证,并以多态性SSR分子标记分析宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性.[结果]测序拼接共得到148803个scaffolds序列,scaffold序列长度181~564229 bp,平均1544 bp,总长度230 Mb,N50为5948 bp,GC含量36.94%.宽体金线蛭基因组中三碱基重复SSR位点最多,有136890个,占总SSR位点的68.43%;其次为四碱基重复,有33769个,占总SSR位点的16.88%;六碱基、五碱基、二碱基和单碱基重复分别有11813、7110、6546和3907个,占总SSR位点的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%.基序为AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位点数量最多,其次为ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/GTT,其他基序位点数量较少.有11871个SSR位点设计出引物,占总SSR位点的5.93%;选择的50对引物中有18对引物在8份宽体金线蛭DNA样品中具有多态性;群体遗传多样性检测发现宽体金线蛭江苏高邮群体18个SSR位点的平均等位基因(Na)3.81个,观测杂合度(HO)为0.0000~0.6429,平均为0.3631,期望杂合度(He)0.0701~0.7792,平均为0.4869,群体遗传多样性水平低.[结论]采用高通量测序技术开发SSR分子标记效率高,且新开发的18个宽体金线蛭SSR分子标记多态性丰富,可用于宽体金线蛭资源保护和利用.     

梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性研究

【目的】分析梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性。【方法】从National Center for Biotechnology Information(NCBI)下载4 589条梅表达序列标签(Expressed Sequence Tag;EST),去除无效碱基后进行拼接和简单重复序列(Simple Sequence Repeat)位点查找;设计引物进行PCR扩增。【结果】获得4 392条unigene,长度为2 420.422kb;搜索到776个SSR位点,分布在650条EST上,出现频率为14.8%。随机设计了15对引物,以4个红叶李品种基因组DNA为模板,进行了PCR扩增,有9对引物可以扩增到清晰稳定的产物,6对多态性引物共检测出20个位点,平均每对引物可以扩增出3.3条多态性片段,平均多态性信息含量(PIC)为0.8。【结论】SSR位点在梅EST序列上分布频率较高,梅EST-SSR在红叶李中具有较高的多态性,可用于红叶李亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面的研究。     

小麦叶锈菌特异分子标记建立

利用21对EST-SSR引物、30对SSR引物及40对小麦叶锈菌EST引物,以小麦条锈菌为对照,对小麦叶锈菌基因组DNA进行PCR扩增筛选。三类引物在小麦叶锈菌和小麦条锈菌基因组中分别扩增出55、77、53个稳定条带,其中多态性条带分别为25、36、12个,平均多态性百分率分别为45.45%,46.75%,22.64%。每对引物等位基因数为1~9,3种引物平均等位基因数分别为2.6、2.6、1.3。2对小麦叶锈菌中单一等位基因的EST引物EST-6和EST-23可在小麦叶锈菌中分别扩增出625和384bp的特异片段。进一步用其他6种锈菌和小麦散黑穗病菌对这2个特异引物进行检测,均未扩增出其特异性片段,表明引物EST-6和EST-23在小麦叶锈菌中具有特异性。     

基于RNA-seq数据的小麦条锈菌SSR标记开发

为开发小麦条锈菌基因组编码区内多态性高的SSR标记,应用MISA软件从4个小麦条锈菌分离物转录组测序数据中搜索SSR位点并设计相应引物。结果表明,在小麦条锈菌转录组2 941条unigenes中发现6 083个SSR位点,SSR发生频率为14.13%,平均每9.84 kb出现1个SSR位点。获得的SSR有144种重复基序,单核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的42.33%和39.90%。T和AAC、ATC、CAT分别是单核苷酸和三核苷酸的优势重复基序。转录组中SSR重复次数以5~12次为主,基序长度主要集中在12~20 bp。随机合成100对SSR引物对3个小麦条锈菌分离物基因组DNA进行PCR扩增,有87对引物可以扩增出条带。总之,这些基于转录组发掘的SSR位点出现频率高、类型丰富,在小麦条锈菌群体遗传结构研究、分子标记开发等方面具有一定的应用潜力。     

光皮桦茎叶cDNA文库构建及部分EST序列SSR分析

以光皮桦茎叶组织为材料,构建了cDNA文库。初级文库滴度为1.5×106pfu/mL,重组率达97.3%,插入片段大小在0.5～3.0 kb之间,平均长度约为1.3 kb,表明所构建的文库质量较高,可用于后续基因克隆及基因表达谱的研究。利用微卫星查找软件对获得的224条EST序列进行微卫星位点搜寻及其丰度、分布比较,发现47条序列含微卫星位点60个,占全部EST序列的26.80%;在所有SSRs中二碱基重复最多,为42个,占总数的70.00%,含三、四碱基重复分别占总数的28.30%和1.70%。通过对光皮桦EST序列中微卫星位点信息的发掘分析,为有针对性地设计EST SSR引物、进行遗传多样性分析奠定了基础。      

辣椒疫霉EST-SSRs标记的发掘

通过对GenBank上发布的55 848条辣椒疫霉EST的鉴定,在328条EST中发现331个SSR.在筛选的EST序列中SSR平均密度为每23.7 kb含有1个SSR.在鉴定的SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的59.5%;其次为二核苷酸乖复基元的SSR类型,为39.3%;四核苷酸重复基元的SSR类型最少,为1.2%.设计40对SSR引物对5个辣椒疫霉菌株基因组DNA进行PCR扩增,有27对引物扩增出SSR特征条带,其中有18对引物在5个辣椒疫霉菌株间扩增出多态性条带25条.基于SSR标记进行聚类分析,可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为3类.该研究是辣椒疫霉的SSR标记开发的首次报道,为辣椒疫霉的遗传变异和分子作图等分析提供了一种有效的分子标记系统.     

核桃BES-SSR的开发及在遗传多样性分析中的应用

从NCBI 数据库全部已知核桃MboI 基因组BAC 文库克隆中下载22 740 条末端序列(BAC end sequences, BES)。应用MISA 软件搜索获得SSR 位点4 732 个,平均每2.8 kb 出现1 个SSR。在含有单个SSR 的BES 中,1 ~3 个核苷酸重复的类型占SSR 总数的96.86%,A/ T、AT/ AT、ATT/ AAT 分别为最丰富的单核苷酸、2 核苷酸和3 核苷 酸重复。选择不同类型和重复次数的SSR 设计合成50 对引物,从中筛选出多态性引物33 对,其中19 对引物扩增 出1 或2 个等位基因,无非特异扩增产物。应用这19 对引物对20 份核桃属不同种的基因型进行SSR 分析,结果表 明,每对引物检测到2 ~9 个多态性位点,平均多态性位点5.4 个;其中17 个位点的多态信息含量高于0.5,总平均 值为0.662,多态性较高。聚类分析显示,不同基因型按照种属分类及地理起源分组。因此,BES-SSR 是一类多态 性高,可用于核桃属植物遗传分析的新SSR 引物。      

从绵羊UniGene数据库中筛选微卫星标记的初步研究

为了利用生物信息学方法筛选绵羊微卫星标记,利用SSRIT和SSRFinder软件对绵羊UniGene数据库的4 081个簇进行搜索,筛选绵羊EST-SSRs标记。结果表明,从绵羊UniGene数据库中搜索到微卫星136个,含有微卫星的序列121个,占整个EST序列数据库的3.0%,其中双碱基重复47个,三碱基重复54个,四碱基重复3个,五碱基重复4个,六碱基重复28个。在这些微卫星序列中,AC/TG重复在双碱基类型中最丰富,CTG重复在三碱基类型中最常见,分别占双碱基和三碱基微卫星序列总数的64%和29%。根据筛选到的微卫星序列设计并合成引物30对,在设计的30对引物中,20对引物有扩增产物,且条带清晰,其中有2对引物在小尾寒羊品种内呈现多态。     

大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析

【目的】分析大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析,为大规模开发大花序桉分子标记辅助育种的SSR标记提供理论依据。【方法】通过高通量测序获得大花序桉基因组序列信息,经严格过滤、拼接和组装后获得scaffolds,利用MISA网站对Scaffolds进行SSR位点检索及分析,并利用Primer 5.0对具有较大多态性开发潜力（二基元重复次数≥10、三基元重复次数≥7）的SSR标记进行引物设计,随机挑选48对基因组SSR引物进行有效性检测及有效扩增引物筛选。【结果】大花序桉基因组共含有177750个SSR位点,包括171530个SSR独立位点和6220个复合型SSR位点;SSR发生频率为17.86%,分布密度为1/3.13 kb。大花序桉基因组SSR基元类型较丰富,以单核苷酸重复基元类型数量最多,占基因组总SSR数量的69.33%,其次为二、三核苷酸重复基元类型,分别占基因组SSR数量的21.01%和7.58%,四、五、六核苷酸的重复基元类型所占比例均相对较低,三者的比例含量总和为2.08%。SSR基元类型以AG/CT占绝对优势（16812个）,其次为AT/AT（8193个）和AAG/CTT（4404个）。从48对SSR标记引物中筛选出31对引物能有效扩增出清晰、明亮条带且大小与预期相符,其中有14对在6个大花序桉样本中均呈现多态性,多态百分率为29.17%。【结论】大花序桉基因组SSR位点发生频率高,基元类型较丰富,SSR多态性标记开发潜力大。该研究结果为进一步大花序桉SSR引物开发和筛选,以及开展大花序桉及其他桉树遗传多样性分析和遗传图谱构建提供依据。     

叶蝉EST资源的微卫星信息分析

【目的】分析叶蝉EST序列信息,为其分子标记体系建立、遗传图谱构建及相关致害基因挖掘奠定基础。【方法】利用生物信息学技术对NCBI数据库中的4种叶蝉亚种EST序列进行SSR基序分析与统计,并对筛选出的SSR基序区段进行引物设计,开发出SSR标记。【结果】11044条叶蝉EST序列的总长为5866kb。按照引物筛选设定的参数,筛选获得1946条含有SSR基序的EST序列,占总EST序列的17．6％;其中包含2230个SSR基序并全部获得相应的SSR引物,平均间距为2．63kb。在2～5个核苷酸重复中,3个核苷酸重复为优势基序,占总基序的77．3％,尤以AAT类最丰富,占3个核苷酸重复总数的40．7％;双核苷酸重复中,AG类所占的比例最大,为39．1％。【结论】从叶蝉EST序列中筛选获得2230个SSR引物,以3个核苷酸重复基序所占比重最大。     

杨树叶锈病组织病理学和细胞学研究

对杨树叶锈病(Melampsora larici-populina)从寄主与病原菌互作的组织病理学及细胞学的研究历史、组织病理学事件、栅锈菌发育的细胞学特点以及寄主细胞的抗性反应等方面进行了评述。     

四倍体野生种花生A.monticola全基因组SSR的开发与特征分析

【目的】通过对四倍体野生种花生Arachis monticola（AABB,2n = 4x = 40）全基因组SSR位点搜索,研究其全基因组SSR分布特征及规律,开发并验证其全基因组SSR引物,为花生属植物遗传进化分析及重要性状分子标记开发提供依据。【方法】在华大基因GigaScience数据库下载A.monticola全基因组序列,并利用生物信息学软件MISA进行SSR位点搜索,Primer 3进行引物设计,通过电子PCR进行单位点SSR分析,并随机合成100对SSR引物验证通用性。【结果】SSR在四倍体野生种花生A.monticola基因组上共搜索到SSR位点676 878个,平均每3.8 kb就会出现一个SSR,分布于5 127条scaffold中,单核苷酸至六核苷酸均有分布,且数量上差异较大,以单碱基、二碱基、三碱基为主,三者占SSR总数的94.28%,其中单碱基重复数量最多,占46.71％,密度最高;六核苷酸重复数目最少,分布最稀疏。大多数SSR分布在基因间区,基因区SSR多分布于内含子区域;全基因组共鉴定出395个不同的重复基元,其中A亚基因组342种,B亚基因组356种;A/T是最丰富的重复基元;在1—6个核苷酸的重复基元中,数量最多的依次是A/T、AT/AT、AAT/ATT,AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT、AAAAAT/ATTTTT;整体来看,重复基元的重复次数多集中在50次以内,不同类型的motif的重复次数差异很大;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;B03染色体上SSR数量最多,A08染色体中SSR密度最高。A.monticola全基因组SSR比A.duranensis、A.ipaensis基因组SSR数量多,密度也更高,A.monticola单核苷酸重复最丰富,2个野生种二核苷酸数量最多。共设计出SSR引物192 303对,单位点SSR标记检出率50.35%,单点SSR标记在基因组上的分布呈现两端密集,中间稀疏的特点;随机合成的100对引物中,90对能在A. monticola中扩增出稳定清晰的条带,且在4份不同的花生基因组DNA中扩增目的条带表现出不同的特点。【结论】A.monticola基因组内SSR种类和数量丰富,单核苷酸至六核苷酸均有分布,单核苷酸重复基元数量最多,且最密,六核苷酸重复基元数量最少,出现频率最低,不同重复基元频数高低与核苷酸数量没有严格相关性,SSR多分布在基因间区,基因区内含子区域SSR数量最多;A.monticola A、B亚基因组具有其各自特异的重复基元类型;单个类型重复基元数量最多的均为AT富集的重复基元,而GC富集的重复基元相对较少;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;A.monticola全基因组SSR较2个二倍体野生种数量更多,密度也更高且重复基元分布规律不同;经过初步验证,开发的SSR引物在4份花生材料中表现出部分通用性。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

小麦EST SSR的分析及其引物的开发

 为开发出具有丰富多态性的、新型的小麦EST SSR标记,利用已公布1071367条小麦表达序列标签（expressed sequence tags,EST）序列,对≥24bp的微卫星或简单重复序列进行了系统分析。结果表明,在所分析的小麦EST序列中,搜索到长度大于或等于24bp,基序匹配值大于80%的SSR序列32350个。在这些SSR中,单碱基SSR最多,数量达18075个,占SSR总数的559%;其次为3核苷酸SSR,共6106个,占SSR总数的187%,重复数大于30次以上的达444个,占所有3核苷酸SSR的72%。4核苷酸SSR数量最少,仅有696个,仅占SSR总数的22%。研究中收搜索到的6核苷酸SSR共1562个,其基序组成可分为145类,优势基序为AGCCGC（达214个）。以上结果说明小麦EST序列中含有丰富的SSR,这非常有利于开发多态性较高的EST SSR标记。     

油松胚珠转录组微卫星特征分析

为利用微卫星分子标记技术进一步研究油松胚珠发育分子调控机制以及微卫星对油松胚珠发育的影响,本文以前期高通量测序结果为基础,用MISA软件对所获得的转录组数据进行SSR位点的发掘和分析,为后续研究提供重要信息资源和数据保障。得到的1412个SSR位点存在于1274条序列中,平均每2.15kb出现一个SSR。油松胚珠转录组微卫星中存在87种重复基元,其中(A/T)n比例最高,约占45.89%;出现频率较高的重复类型是单核苷酸(46.88%)和三核苷酸(34.99%)重复。所得微卫星多为长度<20bp的短重复序列,≥20bp仅占总数的5.67%,重复序列出现频率与长度呈负相关。所得的SSR位点大部分位于非编码区,位于编码区的仅232个,有18个跨越了编码区和非编码区;编码区中占比例最高的是三核苷酸重复序列(105个,45.26%)。