鸭TLR3基因胞外区的原核表达及抗体制备

采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,表达重组TLR3蛋白,并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示,PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区,用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔,制备TLR3的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区,用该蛋白免疫实验兔后,制备的多抗能与TLR3特异性反应。     

绵羊梅迪-维斯纳病毒CA蛋白可溶性表达、多克隆抗体制备及鉴定

[目的] 制备绵羊梅迪-维斯纳病毒（maedi-visna virus,MVV）衣壳蛋白（capsid protein,CA）多克隆抗体,并鉴定其特异性。[方法] 根据MVV内蒙古分离株CA基因序列设计特异性引物,扩增CA基因,构建重组质粒;对 CA重组蛋白进行原核表达及纯化,制备兔源MVV CA重组蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定其抗体效价,利用Western blot和免疫组化方法对其进行特异性鉴定。[结果] 成功构建MVV CA重组蛋白原核表达系统,纯化后的目的蛋白大小约27 kDa;间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价为1:8 192;Western blot检测感染MVV绵羊的病肺组织,在25 kDa处出现特异性条带;免疫组化结果显示感染MVV绵羊的病肺中巨噬细胞的胞浆内有明显棕黄色阳性信号。[结论] 利用获得的可溶性重组MVV CA蛋白制备的多克隆抗体具有较好特异性,可为MVV血清学诊断技术提供检测抗体。     

基因Ⅱ型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

旨在利用原核表达系统表达基因Ⅱ型鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)ORF2蛋白,制备兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。根据GoAstV-GDZJ37株ORF2基因序列设计特异性表达引物,利用RT-PCR方法进行目的基因扩增,将其连接至原核表达载体pET-32a(+);经酶切鉴定和测序正确后,转化至表达感受态细胞,并进行诱导表达及SDS-PAGE分析。以无His标签的ORF2蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体。将含His标签的ORF2蛋白经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后的蛋白作为检测原,通过I-ELISA方法检测兔源多克隆抗体的效价,并通过Western blot及IFA检测方法鉴定其特异性。结果显示,克隆获得GoAstV-GDZJ37株ORF2基因,并利用原核表达系统分别表达2种重组蛋白,大小分别为77、95 kDa,且均为不可溶性表达。I-ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶102 400,表明无His标签的ORF2蛋白具有良好的免疫原性;Western blot及IFA结果显示,多克隆抗体可与含His标签...     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。     

双峰驼FCGRT基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备抗双峰驼FcRn的抗体,首先从NCBI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒pET-28a-FcRn,然后在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达及表达条件优化,用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔,制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体,并通过间接ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的FcRn重组蛋白与预期大小一致(34 ku),且以包涵体形式表达,其最佳IPTG诱导浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为6 h。ELISA检测抗体效价为1∶32 000,Western blot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合。说明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体。     

双峰驼IgA基因的原核表达及抗体制备

为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1∶32 000,Western blot鉴定抗体能特异性识别原核表达的pET-28a-IgA-H蛋白,并能有效地将双峰驼IgA与IgG区别开来,表明成功获得了双峰驼IgA重链恒定区的重组蛋白及特异性良好的多克隆抗体。     

口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。     

猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。     

绵羊肌肉抑制素C-端的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理.     

四川省一些实验动物养殖场SPF大鼠和小鼠肠内容物中金黄色葡萄球菌的检测

调查四川省一些实验动物养殖场的实验动物中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)携带情况,找出传播途径和进化规律,分析其污染原因,为保障实验动物质量提供技术支撑。按照GB/T 14926.14-2001《实验动物金黄色葡萄球菌检测方法》对2011年-2017年四川省部分实验动物中SA进行检测,对分离的SA菌株进行PCR耐药基因mecA检测,并应用金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A,SPA)和脉冲场电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)进行分子分型。结果显示,2011年-2017年共从7家实验动物养殖场采集并完成370只实验动物中SA的检测,共检出SA 31株,总分离率为12.16%,且均从SPF大鼠中分离所得。31株SA的mecA基因均为阴性。SPA可分成5个型别,其中T2360为优势型别,PFGE型别有10个带型。四川省养殖实验动物中仅SPF大鼠携带SA,不同年份检出SA基因型别基本不同,不同养殖场同一年检出的SA具有相同基因型,说明不同养殖场中的SA可能来自同一污染源,应加强SPF大鼠监控,以确保实验动物的质量。     

家蚕狭胸(narrow breast,nb)突变性状观察及基因的精细定位

狭胸(narrow breast,nb)是家蚕少数几个体型突变种之一,其表型为胸部狭小,位于19号染色体的31.2位点,该突变为自然隐性突变。到目前为止,其突变基因还未被分离克隆,突变机理未知。为了分离克隆nb的突变基因,阐释其突变机理,本研究首先对nb蚕的突变性状进行观察。发现3龄时,nb狭胸表型开始明显,并维持到蛹期。5龄期的nb与野生型的体重没有明显差异,但nb体长明显的比正常表型短。5龄5d解剖观察发现nb和野生型个体前肠存在差异,nb前肠在食道处收缩,而正常个体是逐渐变大且呈漏斗状。同时,本研究还采用大造和nb为亲本构建BC_1群体,通过筛选合适的SNP标记对nb突变基因进行了精细定位,其结果为:利用10 SNP个标记和92个BC_1代个体进行连锁分析,将nb突变相关基因位于标记3和8之间的区域内,遗传距离为7.8cM,物理距离约为1.7Mb。利用13个可用于定位的标记和1794个BC_1代个体,nb突变基因位于标记31和38之间区域内,该区域物理跨度约为1Mb,基因预测结果显示定位区域内含有44个基因。本研究为nb突变基因的定位及机理的阐释提供了参考信息。     

不同青贮玉米品种抗病性评价

对10个青贮玉米品种自然发病情况进行调查,并采用病级分类方法对抗病性分类。结果表明:对锈病表现抗性和中抗的品种有3个和5个,分别占供试品种的30%和50%;对大斑病表现抗性和中抗的品种有4个和5个,分别占供试品种的40%和50%;对褐斑病表现抗性和中抗的品种有6个和3个,分别占供试品种的60%和30%;对小斑病表现抗性和中抗的品种有6个和3个,分别占供试品种的60%和30%。多数品种对青贮玉米4种病害抗性表现较好,可从青贮玉米供试材料中选用优良抗病材料用于四川地区种植。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

玉米秸秆不同部位营养成分、体外消化率和有效能的比较

为了高效利用玉米秸秆各部位,采用近红外漫反射光谱法,以整株玉米秸秆作为对照,对玉米秸秆不同部位(茎髓、茎皮、苞叶和叶片)的营养成分,干物质(DM)和中性洗涤纤维(NDF) 30、48 h体外消化率、有效能和吨干物质产奶量等进行了测定。结果显示:粗脂肪、粗蛋白在叶片中含量最高,茎皮中最低;苞叶中的淀粉、总可消化养分和非纤维性碳水化合物含量最高;茎皮中的酸性洗涤纤维、木质素的含量最高,苞叶和叶片中含量较低;苞叶的DM (48 h)和NDF (30,48 h)的体外消化率最高,显著高于叶片、茎髓、整株秸秆、茎皮(P<0. 05);苞叶的有效能和吨干物质产奶量显著高于其叶片(P<0. 05),叶片显著高于茎髓、整株秸秆、茎皮(P<0. 05)。综合以上指标比较,玉米秸秆各部位的综合营养价值存在差异,从高到低的顺序为苞叶>叶片>茎髓>整株秸秆>茎皮。     

稚蚕期O_2含量变化及对家蚕生长发育的影响

在实验条件下,饲养框内的O_2含量随家蚕的生长和时间的延长而减少,2龄眠蚕体重与O_2含量有强相关性,全茧量、茧层量等指标无显著差异;添食1.0×10~5 PIB·mL^-1、1.0×10~6 PIB·mL^-1、1.0×10~7 PIB·mL^-1的BmCPV,随着O_2含量的降低,家蚕对BmCPV的抵抗力也随之降低,说明保持饲养环境的O_2含量对增强家蚕体质具有重要意义。     

褪黑素对家畜冻精品质影响的研究进展

目前,家畜精液冷冻技术已发展得较为成熟,但精液冻后质量仍达不到理想的效果,其中冷冻-解冻过程中的氧化应激是影响精液品质的主要因素之一。褪黑素是一种具有较强抗氧化作用的胺类物质,本文主要综述了褪黑素的抗氧化作用及其对家畜冻精品质影响的研究进展,旨在为褪黑素在家畜冻精生产中的应用提供参考依据。     

影响荷斯坦牛产犊难易的原因分析

通过研究不同胎次、产犊季节和犊牛初生重、犊牛性别、产犊方式等因素对荷斯坦牛难产程度的影响,旨在降低难产率,帮助牛场制定合理有效的繁殖管理措施。试验收集上海金山奶牛场2018年1~12月产犊难易记录共2 812条,采用GLM模型对影响奶牛难产程度的因素进行分析。结果表明,胎次、产犊季节、犊牛初生重、犊牛性别、产犊方式对难产程度有显著影响(P<0.05),且第二胎奶牛自然分娩比例最高;春季和夏季产犊低难产度所占比例较大;随着犊牛初生重的增加,难产程度逐渐增大;生公犊难产程度越大;双胎生产方式难产度增大。     

内质网应激标记基因Grp78参与鹅肥肝免疫/炎症状态的调控

旨在揭示内质网应激(ERS)标记基因Grp78是否参与鹅肥肝中炎症/免疫相关基因的表达调控。本试验选择健康的、体重相近的70日龄朗德鹅30只(未分公母),随机分为对照组(n=15)和填饲组(n=15)。利用荧光定量PCR测定不同填饲阶段(填饲7、14、19 d)不同组织中Grp78的相对表达量(n=4),以明晰Grp78与鹅肥肝形成的关联;在鹅原代肝细胞中过表达Grp78,并通过RNA-seq分析Grp78所影响的信号通路和基因(n=3);利用荧光定量PCR检测鹅肥肝中与炎症/免疫相关的基因表达量(n=4),以明晰这些基因与Grp78的关联。结果表明,肝和腹脂中Grp78的表达量受填饲影响(肝中下降,而腹脂中上升)。Grp78基因的过表达试验表明,ERS除了可影响已知的代谢病和细胞凋亡通路外,还影响信号转导、免疫等通路。在免疫/炎症方面,"Toll-like receptor signaling pathway"、"TNFαsignaling pathway"、"NF-kappa B signaling pathway"等通路最为突出。此外,免疫/炎症相关基因Tnfsf10、Map3k7cl在鹅原代细胞中的表达受Grp78过表达影响,在鹅肥肝中受填饲影响。总之,本研究揭示了Grp78/ERS新的生物学功能,即对细胞的免疫/炎症状态进行调控,并借此参与鹅肥肝的形成。