猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

黄孢原毛平革菌过氧化物酶的分离、纯化和酶学特性研究

从木质素降解菌Phanerochaete chrysosporium中纯化出两种木质素降解酶：木质素过氧化物酶（LiP）和锰依赖过氧化物酶（MnP）。经测定LiP和MnP的分子量分别为37kD和40kD，最适作用温度均是37屯；保温2h，LiP的半失活温度为40℃，MnP为45℃；LiP最适作用pH2．8，稳定pH2．2—5．2；MnP最适作用pH4．6，稳定pH4．0—7．0。Fe^2＋LiP和MnP均表现出促进作用，Na^＋、K^＋、Ca^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋、Fe^3＋、Ag^＋、CO^2＋、NH4^＋对LiP有促进作用，对MnP则表现出抑制作用。与此相反，Mn^2＋对MnP酶活的高效促进作用，对LiP表现出了轻度的抑制作用，这也体现出了MnP对Mn^2＋的依赖性。Cu^2＋对LiP活性无影响，而对MnP有强烈的抑制作用。Fe^3＋两者活性的抑制都达到了90％。     

生物技术对环境微生物的构建及行为控制

微生物代谢方式的多样性使其具有降解环境污染物的能力,生物技术则为优化这一能力提供了强有力的工具。运用生物技术可以进化出微生物新的代谢能力,甚至可以将不同微生物的代谢片段组装起来,建立全新的代谢途径。生物技术还为加强生物防护提供了有效保障。本文回顾了近年来生物技术在改造环境微生物及对环境微生物行为控制方面的进展及应用。     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建与转化

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出大约1．5kb的片段．PCR产物经回收后，与Pc^CAMBIA1303连接并转化大肠杆菌DH5α，阳性重组子经PCR鉴定，表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体．用基因抢转化小麦幼胚，经组织培养得到了含有海藻糖合成酶基因的小麦植株．     

土壤中五氯酚的测定及其生物降解研究

探索了土壤中五氯酚的测定方法。在藏红T分光光度法的基础上 ,用蒸馏法直接提取土壤中的五氯酚进行测定 ,效果较好 ,克服了常用的超声提取及萃取方法测定结果不稳定的弊端。当土壤中五氯酚浓度为 5 0～ 1 0 0mg/kg时 ,采用上述方法测定回收率为 85 .5 0 %～95 .38% ,灵敏度为 0 .0 1mg/kg。此外在利用黄孢原毛平革菌对灭菌土壤中五氯酚的降解试验中 ,应用上述方法成功地进行了土壤中五氯酚的测定。当土壤中五氯酚污染水平为 5 0～2 0 0mg/kg时 ,黄孢原毛平革菌对五氯酚具有较强的降解作用。     

饲料中霉菌毒素的污染概况

霉菌是广泛存在于自然界中的多细胞真菌微生物,生长、传播速度快。其产生的霉菌毒素是对食品、饲料生产危害最严重的一类毒素。危害最大的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素等。饲料发霉产生的霉菌毒素是造成饲料浪费和动物疾病的主要原因之一。变质的饲料不仅影响动物健康,最终也影响人类健康。     

民猪肠道菌群特征分析

试验旨在解析不同月龄民猪的肠道菌群特征及粗纤维对民猪肠道微生物的影响。选择5头体重为(100±7.24)kg的10月龄成年母猪(成年组)和(50±4.31)kg的6月龄青年母猪(青年组),青年组又分为正常饲喂组(5头)和添加粗纤维组(4头),采集同一时间、新鲜的粪便样品,提取总DNA,利用带标签的通用引物扩增16S rRNA V4区,使用Illumina Hiseq 2000测序平台测序,通过计算Ace和Shannon多样性指数以及与已知数据库的比对,分析菌群多样性及结构特征。结果表明:3个处理组在菌群多样性方面无显著差异(P0.05);3组均以拟杆菌门、厚壁菌门和螺旋菌门所占的比例最高,总计可达91%~92%,粗纤维的添加明显改变了青年组肠道微生物的组成,大幅提升了拟杆菌门所占的比例,降低了厚壁菌门和螺旋菌门所占的比例,使其菌群分布比例更接近成年个体;同时,粗纤维的添加也促进了肠道微生物内纤维杆菌属的增加。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。