小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达与间接ELISA检测方法的建立

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,也是诊断小反刍兽疫的主要靶蛋白。为获得高效表达的可溶性N蛋白,并建立基于N蛋白的小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,通过优化密码子、优化表达条件等条件探索,在大肠埃希菌表达系统中获得了高效表达的可溶性N蛋白,进一步基于N蛋白建立了间接ELISA检测方法,该方法对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数均低于9%,具有良好的重复性。对480份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,符合率达到98.33%。本研究为进一步开发成熟的小反刍兽疫抗体检测试剂盒奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白抗原性与特异性的比较

为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。     

原核载体表达的小反刍兽疫病毒N蛋白的保存期与相关抗原性、特异性研究

为明确使用原核表达载体pET-32a表达纯化的小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)的最佳保存期,检测其相关抗原性与特异性,通过优化N抗原序列的密码子和蛋白表达纯化条件,在大肠杆菌表达系统中成功获得了3批次高效表达的小反刍兽疫病毒可溶性重组N蛋白。将3批次小反刍兽疫病毒N蛋白放置2～8℃保存,分别于1、2、3、6、9、12、15个月检验蛋白性状、蛋白浓度、纯度、抗原性和特异性等指标。经分析,各个时期蛋白的抗原浓度、抗原性、特异性等要素均符合标准,N蛋白保存15个月后,依然具有较强的检测抗原性与特异性。该研究结果为今后以小反刍兽疫N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法奠定了坚实的基础。     

小反刍兽疫病毒N基因的克隆及原核表达

根据小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria75/1的全基因序列,通过PCR方法,将N基因亚克隆入pBAD/TOPO表达载体,构建了原核表达质粒pBAD-PPRN。该重组质粒转化至大肠埃希菌TOP10中,经L-Arabinose诱导,SDS-PAGE和Western blot检测,表达的重组N蛋白分子质量与预期的73.6ku一致,为以小反刍兽疫N蛋白为抗原的诊断试剂盒研制奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备及间接ELISA检测方法的建立

将编码小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的基因全长克隆到pBacPAK9载体中,并在昆虫细胞中进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用PPRV阳性血清进行了Western blot鉴定。用Ni-IDA亲和柱对组氨酸融合表达的N蛋白进行了纯化,并对纯化产物进行了理化性质和抗原活性分析。最后以表达的N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,临床检测137份山羊血清并与IDvet公司的商品化PPRV抗体检测试剂盒进行比较。结果表明,制备的PPRV N蛋白抗原在溶液中以单体形式存在,具有非常好的抗原活性。用该蛋白建立的间接ELISA检测方法与IDvet试剂盒符合率为956%。本研究为小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备相关质量标准的建立奠定了基础,同时建立的ELISA抗体检测方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用

桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因(cp)序列中含有较多大肠埃希菌(Escherichia mori)BL21(DE3)的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显著提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。     

小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究

为研究小反刍兽疫病毒（PPRV）竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。     

小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

接种红色荧光蛋白标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长及结瘤能力的影响

将含有红色荧光蛋白(RFP)基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5-rfp2,S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3接种于甘农5号和WL343HQ紫花苜蓿,分别测定2个苜蓿品种幼苗的生物量、生长指标、固氮酶活性等指标。结果表明:RFP标记根瘤菌与出发菌相比对苜蓿幼苗生长无显著影响,与不接菌的苜蓿幼苗相比有明显的促生效果,能稳定的在苜蓿幼苗体内表达,并具有与出发菌无差异的促生能力,2个苜蓿品种间也无特异性。     

云南半细毛羊6种蛋白质饲料的可消化粗蛋白质和有效能的评价

本试验旨在利用概略养分分析法测定半细毛羊6种蛋白质饲料原料[豆粕、干酒糟及其可溶物(DDGS)、棉籽粕、膨化大豆、玉米蛋白粉和菜籽粕]的营养成分含量,并通过消化代谢试验结合套算法实测饲料原料的可消化粗蛋白质(DCP)含量和有效能值。试验选取16只体重为(56.05±5.47) kg的云南半细毛羊,采用完全随机设计,平均分为4组,每组4只。试验共2期,共7个饲粮,包含1个基础饲粮和6个试验饲粮。第1期饲喂4种饲粮,第2期饲喂3种饲粮。试验期10 d,其中预试期5 d,正试期5 d。结果表明:1)玉米蛋白粉的粗蛋白质(CP)含量最高,为65.77%,棉籽粕和豆粕的CP含量为50%左右,膨化大豆和菜籽粕的CP含量为37%左右,DDGS的CP含量最低,为25.93%。菜籽粕和膨化大豆的粗纤维(CF)含量较高,为16%左右,DDGS和棉籽粕的CF含量为11%左右,豆粕和玉米蛋白粉的CF含量较低,均在6%以下。2)各种蛋白质饲料原料的DCP含量之间差异显著(P <0. 05),其中玉米蛋白粉的DCP含量最高,为581. 79 g/kg,其次是棉籽粕、豆粕、膨化大豆和菜籽粕,DDGS的DCP含量最低,为211.48 g/kg。膨化大豆的消化能(DE)和代谢能(M E)最高,分别为21.54和19.79 M J/kg,其次是玉米蛋白粉、豆粕、棉籽粕和菜籽粕,DDGS的DE和ME最低,分别为14.62和12.45 MJ/kg。棉籽粕、菜籽粕和DDGS的有效能之间差异不显著(P>0.05)。综上所述,从营养成分含量上看,玉米蛋白粉品质最好,其次是豆粕、棉籽粕、膨化大豆、菜籽粕和DDGS。从DCP品质来说,玉米蛋白粉的品质最优,依次高于棉籽粕、豆粕、膨化大豆、菜籽粕和DDGS。从有效能值来说,膨化大豆最优,依次高于玉米蛋白粉、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和DDGS。     

可消化纤维替代蛋白质对肉兔生长性能、能量和氮平衡及盲肠内容物组分的影响

文章旨在研究日粮不同可消化纤维与蛋白质比例对肉兔生长性能、能量和氮平衡及盲肠内容物组分的影响。试验选择32 d断奶的肉兔120只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复5只。试验日粮分为4种,日粮可消化纤维与蛋白质比例分别为1.0(处理1组)、1.15(处理2组)、1.35(处理3组)和1.55(处理4组),试验共进行6周。结果 :处理3、4组较处理1、2组显著提高中性洗涤的表观消化系数(P <0.05),较处理1组显著提高了酸性洗涤纤维和粗纤维表观消化系数(P <0.05)。处理1组半纤维素表观消化系数最低(P <0.05),但可消化蛋白质和蛋能比最高(P <0.05)。处理1组较其他三组显著提高了氮的摄入量(P <0.05),处理3、4组较处理1组显著提高了能量沉积系数(P <0.05),日龄和日粮对尿氮排泄量和氮沉积量的影响具有显著交互效应(P <0.05)。处理1组较处理4组显著提高了盲肠内容物干物质含量(P <0.05)。结论 :日粮采用高比例可消化纤维替代蛋白质可以降低肉兔生长后期粪氨气和尿氮排泄量,提高氮沉积量。     

热休克蛋白27在病毒感染中的作用研究进展

热休克蛋白27(Hsp27)是一种结构上高度保守的小热休克应激蛋白,具有多重生物学功能,在调节蛋白质稳态以维持细胞骨架有至关重要的作用。近年来,热休克蛋白(HSPs)在疾病预防和药物开发中取得较大突破,有研究发现在许多病毒感染宿主细胞后,细胞中Hsp27的表达会发生显著变化,表明Hsp27与病毒感染之间有密切关联,但Hsp27在病毒感染中的应用尚不成熟。论文主要介绍病毒感染宿主细胞后,Hsp27通过抑制细胞的自噬、凋亡、干扰素形成及维持病毒复制等发挥其在病毒感染中作用,此方面研究为以HSPs为靶点研发抗病毒药物提供了新思路。     

弓形虫突触融合蛋白STXQa1对虫体生长的作用研究

为揭示弓形虫突触融合蛋白STXQa1在虫体生长过程中的作用,本研究利用ddFKBP系统构建了STXQa1的条件性过表达虫株。利用间接免疫荧光试验(IFA)观察STXQa1的亚细胞定位,通过westen blot及IFA检测STXQa1蛋白的表达;经IFA检测STXQa1蛋白过表达虫株在细胞内的增殖能力、侵入细胞的能力以及逸出细胞的能力。结果显示STXQa1定位在虫体空泡样隔室(VAC);利用shield1能够快速调控ddFKBP-STXQa1融合蛋白的表达;过表达STXQa1对弓形虫的细胞内增殖具有抑制作用,同时影响弓形虫的侵入及逸出能力。本研究通过对弓形虫独特的突触融合蛋白STXQa1的表达与鉴定,为进一步研究弓形虫分泌细胞器的成熟和蛋白的分泌机制研究奠定了基础。     

凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测饲料粗蛋白质含量的比较

为比较凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定饲料中粗蛋白质含量的准确性与检测效率,采用此两种方法同时对12个样品进行测定。结果表明:两种方法均能准确检测出样品中粗蛋白质含量,测定结果差异不显著(P>0.05)。凯氏定氮法检测效率较低,而杜马斯燃烧定氮法操作简易,检测效率较高,是值得推广的检测方法。     

猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。     

饲喂频率对哺乳仔猪生长性能和骨骼肌蛋白质合成的影响

本试验旨在比较饲喂频率对哺乳仔猪生长性能、胴体组成和骨骼肌蛋白质合成相关基因表达的影响。试验选用来自于4头母猪的16头4日龄的“杜×长×大”仔猪,按体重和性别配对成8对,每对仔猪随机分配到每天饲喂6次组(M6组)和每天饲喂12次组(M12组),每组8头猪,每个配对内仔猪采食量保持一致,人工乳饲喂21 d。结果表明:1)与M12组相比,M6组仔猪的末重,第2周、第3周和全期的平均日增重显著提高(P<0.05),第2周、第3周和全期的料重比显著降低(P<0.05)。2)与M12组相比,M6组仔猪胴体瘦肉率、背最长肌重和半腱肌重显著提高(P<0.05)。3)与M12组相比,M6组仔猪背最长肌胰岛素样生长因子1(IGF1)基因表达量有提高的趋势(P=0.05);与M12组相比,仔猪背最长肌胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核细胞翻译起始因子4E(EIF4E)和核糖体蛋白S6(RPS6)的mRNA表达量显著提高(P<0.05),ⅡB型活化素受体(ACVR2B)和Ⅰ型活化素受体样激酶5(ALK5)的mRNA表达量显著降低(P<0.05);与M12组相比,M6组仔猪背最长肌肌肉生长抑素(MSTN)mRNA表达量没有显著变化(P>0.05)。综上所述,在本试验条件下,降低饲喂频率可促进胴体瘦肉沉积和骨骼肌生长,主要通过上调IGF1 IGF1R mTOR通途路下调MSTN受体表达来实现。     

小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。     

饲粮中添加辣木梗粉对蛋雏鸭生长、免疫及抗氧化功能的影响

本试验通过在饲粮中添加不同水平的辣木梗粉,研究其对1～28日龄蛋雏鸭生长、免疫及抗氧化功能的影响,以探讨辣木梗粉的适宜添加量。试验选取健康、体重相近的1日龄三穗蛋雏鸭135只,随机分为3组(Ⅰ～Ⅲ组),每组3个重复,每个重复15只试鸭。采用基础饲粮加辣木梗粉进行饲喂,Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮,Ⅱ、Ⅲ组在基础饲粮中添加20 g/kg和40 g/kg辣木梗粉,试验期4周。结果表明:20 g/kg辣木梗粉添加组的平均日采食量(ADFI)分别比空白对照组和40 g/kg辣木梗粉添加组显著提高8.6%和9.8%(P <0.05);20 g/kg和40 g/kg g辣木梗粉添加组的平均日增重(ADG)分别比空白对照组显著提高11.8%和18.3%(P <0.05);40 g/kg辣木梗粉添加组的料重比(F/G)分别比空白对照组和20 g/kg辣木梗粉添加组显著降低16.2%和14.1%(P <0.05);20 g/kg和40 g/kg辣木梗粉添加组血清白蛋白(ALB)含量比对照组分别显著提高39.1%和49.5%(P <0.05);20 g/kg辣木梗粉添加组的免疫蛋白M(IgM)含量比空白对照组显著提高了1.6%(P <0.05);20 g/kg辣木梗粉添加组的血清丙二醛(MDA)含量比空白对照组显著减少33.16%(P <0.05)。综上,在基础饲粮中添加适量的辣木梗粉可提高1～28日龄蛋雏鸭的免疫及抗氧化功能,对辣木梗粉在蛋雏鸭的应用上提供了参考依据。