FoxO1突变体转基因小鼠的建立

为探究FoxO1对瘦素信号传导的调节机制，本研究构建了重组质粒pEF1α-myc-FoxO1ΔDBD，并将其转染于293Rb细胞，应用Western blotting检测突变体FoxO1ΔDBD的表达；然后采用DNA原核显微注射的方法制备含有突变体FoxO1ΔDBD的转基因小鼠模型，以鼠尾基因组DNA为模板，PCR扩增鉴定基因型；采用实时荧光定量PCR和免疫共沉淀方法检测FoxO1ΔDBD在转录水平和翻译水平的表达，并对FoxO1ΔDBD转基因鼠进行表型分析。结果显示，试验成功构建了重组质粒pEF1α-myc-FoxO1ΔDBD，并在293Rb细胞中检测到了突变体FoxO1ΔDBD的表达，继而获得了10只首建鼠，建立了10个繁育系。试验建立了高G-C含量PCR扩增产物的基因型鉴定方法，并成功地应用于转基因小鼠中。实时荧光定量PCR和免疫共沉淀结果显示，在转录水平和翻译水平上成功地检测出FoxO1ΔDBD的表达，表型分析结果显示，转基因小鼠体重显著低于野生型小鼠（P < 0.05），提示瘦素的作用增强。综上所述，本试验成功构建了FoxO1ΔDBD转基因小鼠，为探究FoxO1对瘦素信号传导的调节机制提供研究模型。     

禽呼肠孤病毒σA蛋白在HEK293T细胞中的表达

为了正确表达禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白,试验拟构建σA基因的真核表达质粒,并将其在人胚肾细胞(HEK293T)中准确表达,参照GenBank中ARV S2基因序列(登录号为KF741763. 1)设计特异性引物,以pMD18-T-σA重组载体为模板,应用PCR的方法扩增σA基因的特异性序列,并将其克隆到p MD18-T载体中,构建重组pMD18-T-σA表达质粒,再用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ同时双酶切pMD18-T-σA和真核表达质粒pEF1α-HA,将胶回收的σA基因和pEF1α-HA进行连接,构建真核表达质粒pEF1α-HA-σA。真核表达质粒经菌落PCR、双酶切和测序验证正确后,将其转染HEK293T细胞,于24 h后收取蛋白质,通过Western-blot验证目的蛋白。结果表明:本试验成功克隆了ARVσA基因,构建了其真核表达质粒pEF1α-HA-σA,并在HEK293T细胞中表达。说明该蛋白可以在HEK293T细胞中准确表达。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

日本血吸虫TOR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

本研究扩增到日本血吸虫Sj TOR完整的蛋白编码区并将其克隆到p XJ40-FLAG载体的HindⅢ、XhoⅠ酶切位点,构建真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR。将测序正确的质粒转染到293T细胞中进行表达,然后应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot检测其在293T细胞中的表达情况。测序结果表明Sj TOR蛋白编码区为1245 bp,真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR构建成功。转染293T细胞48 h后,应用间接免疫荧光染色可观察到转染重组质粒的细胞有特异性绿色荧光,空质粒对照则未见。实时荧光定量PCR结果显示,在转染质粒p XJ40-FLAG-TOR 6 h后Sj TOR蛋白的基因已有转录,至转染24 h时转录水平最高,随后开始降低。Western blot结果显示Sj TOR蛋白分子量约53 k Da,可被FLAG单抗和抗Sj TOR-ED1抗血清识别。结果表明Sj TOR蛋白可以在293 T细胞中表达,为进一步研究Sj TOR蛋白的生物学功能和DNA疫苗打下了基础。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD真核表达及其功能研究

根据日本血吸虫促凋亡基因SjB AD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增SjB AD,选用pcD NA3.1(+)真核表达载体,构建pcDNA3.1(+)-SjB AD,并将其转染到293T细胞内,采用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养不同时期后的转录水平;利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后细胞的凋亡水平。结果:成功克隆、表达了日本血吸虫SjB AD基因,构建了真核重组表达质粒pcD NA3.1(+)-SjB AD,并将其转染入293T细胞内,利用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养36h后转录水平最高。利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后可以引起细胞凋亡。本文为研究线粒体细胞凋亡通路和血吸虫的生长发育奠定基础。     

Wip1过表达转基因小鼠模型的制备与鉴定

本研究旨在构建Wip1过表达转基因小鼠,并对Wip1过表达转基因小鼠进行RNA水平上的筛选,为研究动脉粥样硬化的发生机制提供一种动物模型。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得小鼠组织的cDNA,并以其为模板进行PCR扩增,对扩增片段进行胶回收,然后进行扩增片段和空载体的双酶切,将酶切后胶回收得到的Wip1基因全长与载体pcDNA3.1（+）进行连接,获得Wip1-pcDNA3.1（+）过表达载体,最终得到Wip1过表达转基因原代小鼠,并利用Southern blotting方法和实时荧光定量PCR方法对小鼠进行鉴定筛选。试验获得Wip1过表达转基因原代小鼠30只,利用Southern blotting方法鉴定出阳性小鼠11只,阳性率为36.67%,实时荧光定量PCR筛选Wip1过表达转基因小鼠阳性率为32.84%。以上结果表明,试验成功构建了Wip1-pcDNA3.1（+）过表达载体,并且经过Wip1基因在小鼠组织DNA和RNA水平上的鉴定筛选,成功获得了Wip1过表达转基因小鼠。     

表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础.     

禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析

为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的真核表达及其初步应用

为验证水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)糖蛋白与半乳糖凝集素1(lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS1)之间的相互作用,本研究将VSV-G全基因插入至真核表达载体pEF1α-IRES-DsRed-Express2中,构建了真核表达质粒pEF1α-VSV-G。在DNA转染试剂的作用下,将pEF1α-VSV-G转染至BHK-21细胞中,转染后24h经荧光显微镜观察即可见细胞内有红色荧光信号。提取细胞蛋白后经Western-blotting检测,证明VSV-G蛋白成功表达。将表达的蛋白与LGALS1共同用于免疫共沉淀试验,Western-blotting检测结果说明表达的蛋白可以用于蛋白相互作用的研究。本试验为深入开展VSV-G蛋白受体的研究奠定了基础。     

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

兔出血症病毒VP60基因真核表达质粒的构建及初步评价

利用pMD18-T-VP60质粒（包含RHDVTP株VP60基因）PCR扩增并酶切回收VP60基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建真核表达质粒pcDNA—VP60,对重组质粒进行酶切和PCR鉴定;将重组质粒转染RK13细胞,进行间接免疫荧光和Western-blot检测;将构建好的重组质粒作为核酸疫苗,腿部肌肉注射免疫小鼠,采用间接ELISA法检测抗体水平;采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞术（FACS）检测细胞免疫情况;采用PCR方法检测重组质粒在小鼠体内的生物安全性。结果显示,成功构建pcDNA—VP60真核表达质粒,并在RK13细胞中获得表达。重组质粒作为核酸疫苗能够诱导小鼠体内产生特异性抗体而且抗体水平随免疫次数增加而逐渐增高,在免疫后49d时达到峰值;脾淋巴细胞刺激指数和CD4＋、CD8＋淋巴细胞亚群数量百分率明显增高,且与对照组存在明显差异。经PCR鉴定VP60基因未整合到小鼠主要脏器染色体上。结果表明,构建的pcDNA—VP60真核表达质粒能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,重组质粒对小鼠是安全的。     

共表达牛病毒性腹泻病毒E0基因和牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的重组质粒DNA构建及其对小鼠的免疫效应

本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。     

共表达牛病毒性腹泻病毒E0基因和牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的重组质粒DNA构建及其对小鼠的免疫效应

本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

鸭疫里默氏杆菌AS87＿05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为探究鸭疫里默氏杆菌(RA) IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87＿05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF^-,回补株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF⁺。采用荧光定量PCR (qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87＿05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_600nm值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10⁷ cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5...     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达

本研究旨在克隆从江香猪FoxO 4基因编码区序列,对FoxO 4基因功能进行初步探究。采用qRT-PCR技术对从江香猪(6月龄)不同组织中FoxO 4基因的相对表达量进行检测;PCR扩增FoxO 4基因CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4;利用脂质体法将重组质粒pEGFP-N3-FoxO 4瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞,通过qRT-PCR方法,检测FoxO 4、PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达水平。结果显示:FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高;构建的重组真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4在从江香猪皮下脂肪前体细胞中成功表达,与对照组相比,LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL基因的表达均显著上调。综上表明,FoxO 4对脂质代谢具有一定的调控作用,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步了解从江香猪脂肪沉积机制提供理论基础。     

NLRP3炎症复合体的体外构建

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。