狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析

【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。     

重组Pen-2乳杆菌的抗感染作用及其对小鼠免疫功能的影响

[目的]在实验室成功构建了含有对虾抗菌肽基因Pen-2的重组乳杆菌L.casei 393/pen的基础上,研究重组乳杆菌L.casei 393/pen经口服小鼠后的抗感染和免疫促进作用.[方法]将昆明系小鼠和balb/c系小鼠随机分为生理盐水组、乳杆菌L.casei 393组和重组乳杆菌L.casei 393/pen组,口服灌胃小鼠.每隔7d测量小鼠体重,28 d后检测小鼠的免疫器官指数和细胞因子IL-6的浓度,并用金黄色葡萄球菌对其进行腹腔注射攻毒.[结果]灌胃28 d后,重组乳杆菌L.casei 393/pen组的体重、免疫器官指数和细胞因子IL-6浓度均明显高于其他2个试验组;用金黄色葡萄球菌攻毒后,重组乳杆菌L.casei 393/pen组的死亡率比乳杆菌L.casei 393低50％,比生理盐水组低83.3％.[结论]重组乳杆菌L.casei 393/pen经口服小鼠后,具有显著的抗金黄色葡萄球菌感染和较好的免疫促进作用.     

广西流行狂犬病毒糖蛋白基因的遗传性分析

[目的]通过测定广西流行狂犬病毒糖蛋白(G)基因的全序列,了解广西狂犬病的流行趋势和遗传变异规律,为制定广西狂犬病的防控策略提供科学依据.[方法]2000年10月~2007年10月,从广西14个市采集1569份动物脑组织,经RT-PCR检测及小白鼠脑内接种试验分离狂犬病毒,然后对狂犬病毒G基因进行测序分析.[结果]从广西各地共分离获得26株狂犬病毒野毒株,其中犬23份,牛、猪、猫各1份.狂犬病毒G基因核苷酸全长2067 bp,开放阅读框1575bp,编码524个氨基酸.根据G基因核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,可将广西流行的狂犬病毒株分成3个群,Ⅰ群15株,其核苷酸同源性为97.7%~99.9%; Ⅱ群10株,其核苷酸同源性为98.0%~99.9%; Ⅲ群只有1株.通过氨基酸变异分析,了解了26株野毒株G基因编码蛋白的氨基酸突变位点.[结论]广西存在3个群的狂犬病毒野毒株,且以Ⅰ群和Ⅱ群流行为主,3个群的氨基酸变异均呈现明显的特异性.     

狂犬病病毒GX074株P-MS20F突变体构建及其生长特性鉴定

【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换弱毒株r RC-HL(GX074P)的M蛋白第20位丝氨酸(Ser),构建r RC-HL(GX074P-M^S20F)突变体感染性c DNA克隆并拯救病毒。以重组突变体感染BSR/T7-9细胞,进行多步生长曲线测定,比较重组突变体与亲本毒株的生长能力,采用Western blotting检测N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达水平,利用实时荧光定量PCR检测N基因、P基因和M基因的相对表达量。【结果】经RT-PCR和测序鉴定,拯救的突变体r RC-HL(GX074P-M^S20F)M蛋白第20位Ser成功替换为Phe。多步生长曲线测定结果显示,构建的重组突变体在感染24、48、72和96 h后,病毒滴度均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1),平均约为亲...     

伪狂犬病毒重组gG抗原片段的原核表达及其间接酶联免疫吸附测定方法的建立

[目的]建立方便可行的伪狂犬病毒血清抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异性鉴别伪狂犬病毒TK-/gG基因缺失疫苗免疫株和野毒株.[方法]利用原核表达系统表达伪狂犬病毒gG抗原片段,蛋白纯化后包被,优化反应条件,建立一种用于检测伪狂犬病毒gG抗体的间接酶联免疫吸附测定方法.[结果]通过不同血清样品的检测试验,该酶联免疫吸附测定方法可以鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫猪和感染野毒的血清学阳性猪.[结论]成功建立了检测伪狂犬病毒gG抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫株和野毒株,此方法敏感性强,特异性高,操作简便,适合于临床大量检测.     

伪狂犬病毒HuB2020株的分离与鉴定

从临床病料中分离纯化1株猪伪狂犬病毒——HuB2020,并对其毒力、培养特性及遗传变异开展了一系列研究。结果表明,该毒株gE基因核苷酸序列与国内PRV毒株的核苷酸序列同源性在98.9%～99.9%。纯化后的病毒经测定其在PK15细胞上的TCID50为107.5/mL;对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为1×10~(5.7)。组织嗜性分布显示,10~(6.0)TCID_(50)/0.1 mL、10~(5.0)TCID50/0.1 mL攻毒组对小鼠的神经嗜性均高达100%,且病毒在脑和心脏中的检出率均高于其他组织。     

猪伪狂犬病毒的分离与鉴定

从河南某发病猪场大批死亡仔猪的脾、肾及脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒(PRV)毒株,该毒株经细胞连续传代培养后,接种PK-15细胞能够产生明显的细胞病变(CPE),且能被PRV阳性血清中和.病毒对氯仿、乙醚敏感,56℃水浴30 min能使其灭活.将所分离的病毒接种家兔和小鼠,均出现明显的伪狂犬病临床症状.PCR鉴定结果表明,用gp50基因序列引物能够从该毒株上扩增出目的条带,将测序结果与GenBank中的5株PRV毒株进行比对分析,同源性达99％.证实所分离病毒为猪伪狂犬病毒.     

大白芸豆植物凝集素毒性研究

[目的]评价植物凝集素的急性毒性反应,为临床应用提供依据。[方法]小鼠腹腔单次注射不同剂量植物凝集素,观察其急性毒性状况和死亡情况.[结果]腹腔注射植物凝集素的结果是昆明小白鼠腹腔注射的肋。是140．24mg／kg,95％置信区间为125．19～178．91mg／kg.[结论]云南丽江大白芸豆植物凝集素属于中等到低等毒性,使用时必须遵照安全剂量范围。     

百里香酚和迷迭香酸对脂多糖攻毒大鼠盲肠屏障、菌群及炎症的影响

[目的]本试验旨在探究百里香酚和迷迭香酸组合对脂多糖(LPS)攻毒大鼠盲肠的屏障功能、菌群结构及炎症反应的影响.[方法]试验选取40只21日龄SD大鼠在适应性饲养7 d后,随机分为5组:空白对照组(Con)、攻毒对照组(LPS)、百里香酚组(Thy)、迷迭香酸组(RosA)、百里香酚×迷迭香酸组(Thy×RosA).T...     

我国首例貉狂犬病简报

中国农业科学院特产研究所野生动物人兽共患病研究室应用RT-PCR方法从临床上疑似狂犬病的貉体内检测到了狂犬病毒,在国内首次证实貉是狂犬病毒的重要宿主。通过对貉脑组织样品狂犬病毒N基因部分片段进行同源性分析表明,该街毒与ERA和CVS毒株核苷酸同源性分别为90%和89%;G基因全序列与疫苗株同源性为85%～87%,与CVS毒株核苷酸同源性分别为87%,存在较大的变异。有关该毒株的生物学特性和其他相关研究正在进行中。     

RV野毒株的鉴定,毒力实验及其核酸探针的研究

对从我国不同地区、不同动物分离的３个疑似狂犬病毒分离物８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ和无毒疫苗株ＳＲＶ９进行了ＥＬＩＳＡ和核酸探针的鉴定。同时，对它们的致病性和毒力进行了测定。结果表明，３个分离物均为狂犬病病毒，其毒力以鼠源ＭＲＶ最强，牛源ＢＲＶ最弱，同地下同动物分离的ＢＲＶ和ＭＲＶ毒力差异很大。疫苗株ＳＲＶ９对１２ｇ小鼠无致病性，研制的狂犬病毒地高辛标记核酸探针敏感性高，特异性强，适用于对狂犬病病料进     

广东省狂犬病病毒分离株N基因的序列分析

[目的]确定广东地区狂犬病毒流行毒株,更好地防控狂犬病。[方法]对2009年从广东省各地采集的犬脑和对应唾液腺进行直接免疫荧光和巢式RT-PCR检测,并通过颅内接种乳鼠进一步鉴定毒株。PCR扩增分离株的N基因,测定其核苷酸序列,并将其与广西地区的流行毒株和疫苗株进行了比对。[结果]分离到2株狂犬病毒毒株,其N基因序列与广西分离到的病毒具有极高的相似性（97.9%～99.4%）,与狂犬病毒疫苗株的相似性为87.7%～88.1%。[结论]外表健康犬只可能携带狂犬病毒,且狂犬病毒的流行存在明显的地域差异。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

[目的]了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础.[方法]运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05( H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析.[结果]扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151 bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717 aa.经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%~ 100.0%和98.5%~99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近.[结论]广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题.     

鹅副粘病毒感染的诊断

[目的]为了确定江苏省某养鹅场2007年春季发生传染病的病因。[方法]从发病鹅群采集病料进行流行病学调查、病原分离鉴定、红血球凝集试验和红血球凝集抑制试验,通过交叉HI试验测定F2代分离株和Lasota毒株的HI效价,并用稀释的F2代感染鸡胚尿囊液分别感染鹅和SPF雏鸡,观察其发病和死亡情况。[结果]通过SPF鸡胚接种与传代从病、死鹅的脑、脾、胰混合病料分离到1株病毒。经HA和HI试验证明该分离株为禽I型副粘病毒。人工感染鸡和鹅试验表明该分离株对鸡和鹅都具有高致病性,同群混饲试验表明该分离株具有很强的传染性,属强毒型NDV。这进一步证实该病毒属禽副粘病毒的新成员,即鹅副粘病毒I型。[结论]该研究为NDV出现了某些新的致病特点以及其对鹅同样具有致病性提供了佐证。     

黄牛狂犬病病毒的分离和鉴定

应用鼠脑传代,从具有神经症状的病牛脑组织中分离获得5株病毒,经电子显微镜观察呈典型弹状病毒样粒子.用抗狂犬病毒CVS(狂犬病毒Ⅰ型代表株)免疫血清作ELISA检测及小鼠中和试验,证明分离株病毒为狂犬病毒.用狂犬病相关病毒Lagos bat(狂犬病毒2型)、Mokola(狂犬病毒3型)和Duvenhage(狂犬病毒4型)免疫血清对分离株病毒作交叉中和试验,结果发现分离株病毒与Duvenhage有较密切的抗原联系.而与Lagos bat及Mokola病毒没有抗原联系.用自制狂犬病毒“核蛋白”单克隆抗体作夹心间接ELISA检测分离株病毒的感染鼠脑均呈阳性反应,5株病毒与CVS及其互相之间没有明显差异.结论认为,由河南省黄牛分离的病毒为狂犬病毒.     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因,并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物,对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1 716和1 662 bp,与GPV-SF02株的同源性均在97.3%左右,与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80.3%~97.5%,与M iyadera株的同源性仅84.8%。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒(A PMV-1)强毒株特征相符,属于A PMV-1基因Ⅶ型。     

一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组测序及其分子特征

[目的]测定一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组序列及其分子特征。[方法]分离出一株具有特殊分子特征的鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）超强毒株（vvIBDV）HLJ-0504,并对其基因组进行了克隆和测序。[结果]序列分析显示,HLJ-0504的基因组A节段属于超强毒株,而其B节段则来源于另外一个独特的祖先。动物实验表明,HLJ-0504对SPF雏鸡的致病率和致死率分别为100%和86.7%。[结论]具有独特基因组B节段的vvIBDV仍在我国流行,我国IBDV的进化特征存在多样性。IBDV的毒力不是由基因组的A或B单独决定的。