H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物，其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物，另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物，通过对多重RT—PCR扩增条件的优化，成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RT—PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明，该技术对AIV H5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段；对AIV H7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段；对AIV H5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段；对其他AIV HA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段；对其他常见禽病病原扩增均为阴性；该多重RT-PCR对AIV RNA、AIV H5和AIV H7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100Pg。     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中H10亚型和N8亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守序列,分别设计筛选出2对特异性引物,用于H10亚型和N8亚型AIV的检测,优化引物之间的浓度,建立了同时检测H10亚型和N8亚型AIV的双重RT-PCR检测方法。该方法对H10N8亚型AIV可特异性扩增出267 bp(H10亚型)和464 bp(N8亚型)目的条带,对H10Ny(y≠8)亚型AIV仅扩增出267 bp目的条带,对HXN8(x≠10)亚型AIV仅扩增出464 bp目的条带,对其他亚型AIV和常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该方法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限均为104拷贝数/μL。本研究建立的H10亚型和N8亚型AIV双重RT-PCR特异性强、灵敏度高,可同时快速检测H10亚型和N8亚型AIV,为其感染的快速鉴别诊断提供一种简便、快速和有效的方法。     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H1和H3亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立

为建立简便、快速同时检测H1和H3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,根据GenBank中H1亚型AIV-HA基因和H3亚型AIV-HA基因的序列,分别设计了2对针对H1AIV和H3 AIV的保守基因序列的引物.应用这2对引物对混有H1 AIV和H3 AIV的模板进行二重PCR扩增,得到了2个特异性扩增条带,大小与试验设计相符的302 bp(H1 AIV)和626 bp(H3 AIV),而对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体的PCR扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出50Pg的H1 AIV模板和26 pg的H3 AIV模板.     

禽流感病毒 H9和 N2基因双重 RT-PCR 方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术的建立与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,参考Gen Bank登录的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA、M基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计3对可扩增HA、NA、M基因的特异性引物以及反转录引物。3对引物扩增的c DNA片段大小分别为1 742、1 410、1 027 bp。结果:通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,与目的片段大小相符的片段,经测序均正确,且与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对HA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对NA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对M基因的最低检出量为10-3μg/μL c DNA。通过对30份H9N2阳性病毒液进行三重PCR,均可同时扩出HA、NA、M基因。结果表明,本试验建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,为提高H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M基因序列分析的效率奠定基础。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）检测效率，及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域，设计并合成了相关探针和引物，建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法，该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时，确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示，该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，经检测，其中有60份样品为流感病毒阳性，且全部是H9亚型，该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致，κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测，将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段、大小分别为490 bp和686 bp;该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速,敏感特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。