绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。     

羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

一种基于ITR序列的羊痘病毒TaqMan探针荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测羊痘病毒的方法,试验根据羊痘病毒[绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)]末端反向重复(ITR)序列的保守区设计了1对特异引物和TaqMan探针,通过优化反应体系建立了一种检测羊痘病毒的TaqMan探针荧光PCR检测方法。结果表明:该方法对羊痘病毒具有良好的特异性,不与猪痘病毒(SWPV)、鸡痘病毒(FPV)、羊传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)及口蹄疫病毒(FMDV)发生交叉反应。该方法对质粒标准对照(PCR~2.1-GPTV-ITR)的最适线性检测范围为2.3×10~1~2.3×10~8拷贝/μL,标准曲线方程为Y=-3.416 2X+38.605,相关系数(R~2)为0.999 9,检测下限为23拷贝数。对3个不同浓度的PCR~2.1-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验检测,每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对来自安徽、广西和天津地区的36份临床样本进行羊痘病毒检测,其中18份样本羊痘病毒核酸检测为阳性。说明本方法可用于羊痘病毒快速、准确检测。     

羊痘病毒中免疫抑制分子的发现以及在疫苗中的应用

正山羊痘病毒(GTPV)是痘病毒科羊痘病毒属中的重要成员。羊痘病毒属有三个成员,GTPV、绵羊痘病毒(SPPV)和牛皮肤疙瘩病毒(LSDV)。三种病毒基因组高度同源,同源性高达95%以上。山羊痘和绵羊痘主要在亚洲以及非洲地区流行;牛皮肤疙瘩病(LSD)在我国尚无流行报道。但目前,已经在我国周边国家流行,给国内养牛业带来巨大威胁。目前,关于GTPV致病力以及免疫逃避机制的研究鲜     

羊痘病毒活载体疫苗研究进展

广义的"羊痘"包括山羊痘、绵羊痘和结节皮肤病,是羊、牛等反刍动物的重要皮肤传染病,三者分别由山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和结节皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)感染引起,也可交叉感染。GTPV、SPPV和LSDV同属于痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,三者统称"羊痘病毒(capripoxvirus, CaPV)"。CaPVs基因组为两端共价闭合的线性双链DNA,对外源基因容纳性较强。病毒本身具有强启动子,可启动外源基因的转录进而对其进行蛋白表达。因此,CaPVs是理想的活疫苗载体,可在体内表达外源抗原并诱导特异性免疫反应。文章综述了CaPVs的基本特征、弱毒活疫苗及CaPV活载体疫苗的研究进展,以期为CaPV活载体疫苗的研究提供参考。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

绵羊痘病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立快速检测绵羊痘病毒(SPPV)快速检测方法基因的方法,本研究参照SPPV ORF068基因设计并合成一对特异性引物和一条MGB探针,经条件优化,建立了SPPV TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测SPPV,而对羊口疮病毒和猪水疱病病毒等扩增结果均为阴性;而且检出下限为10拷贝/μL;组内组间重复性试验的变异系数均小于3%。上述结果显示本研究建立的TaqMan-MGB qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够对SPPV进行快速准确的检测。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

羊痘病毒基因组及其功能研究概况

<正>羊痘病毒(sheeppox and goatpox virus,SGPV)属于羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV),包括绵羊痘病毒(sheeppox virus,SPPV)和山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV),引发的羊痘(sheeppox and goatpox,SGP)是羊的一种急性、热性、接触性传染病。受感染的羊群皮毛质量下降,或造成羔羊的大批死亡,是     

山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及CBP基因的序列分析

根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列,设计合成1对引物,通过对PCR条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了ORFV的PCR检测方法。敏感性与特异性结果显示,最低核酸检测量为1.2 fg/μL,对口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状支原体山羊亚种的扩增结果均为阴性。同时根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列,设计合成1对特异性引物,以ORFV贵州分离株作为模板,成功克隆出ORFV的CBP基因。同源性分析表明,核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的核苷酸序列相似性99.4%～88.8%。本研究为ORFV感染的流行病学调查和CBP基因功能研究奠定基础。     

多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。     

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

Peste des petits ruminants virus (PPRV) and goat pox virus (GTPV) are the causative agents of two kinds of goats’ diseases-peste des petits ruminants and goat pox which can cause disaster economic losses. In order to detect the two viruses simultaneously and quickly, two sets of primers and relative probes were designed based on the nucleoprotein (N) gene of PPRV and the inverted terminal repeat (ITR) segment of GTPV， respectively. In order to work together in the same reaction, the probes were labeled with different fluorescent materials 5′FAM-TAMRA3′and 5′JOE-Eclipse3′，respectively. Results showed that the duplex Real-time RT-PCR assay was identified to be specific for PPRV and GTPV only and specific fluorescent signal could be detected, but the related viruses including fowl pox virus（FPV）and canine distemper virus (CDV) had no specific fluorescent signal. Positive recombinant plasmids (PPRV pMD18-T-N and GTPV pMD18-T-ITR) were built and used for positive quantitative templates to establish duplex standard curves. The developed assay based on the probe N-ITR was found to be highly specific and sensitive with a detection limit of 10² copies/μL cDNA and 10³ copies/μL DNA for PPRV and GTPV， respectively. Finally, the duplex Real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of PPRV and GTPV was established preliminarily in the study.     

应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒

研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的多重聚合酶链式反应(多重PCR)技术。根据WSSV和TSV基因序列，设计合成了2对分别与WSSV和TSV某段基因序列互补的引物，用这2对引物对同一样品中的WSSV DNA和TSV RNA模板进行多重PCR扩增。结果均同时得到了2条特异的与实验设计相符的306bp(WSSV)和231bp(TSV)多重PCR扩增带，而对其他对虾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术能检出10pg的WSSV DNA和1pg的TSV RNA模板。     

羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

【目的】 为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】 将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】 OrfV样本经60 ℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20 μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35 μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^-1.68 TCID₅₀/0.1 mL。【结论】 本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。     

Establishment and Primary Application of Duplex PCR Assay to Detect Procine Pseudorabies Virus

In order to detect the procine pseudorabies virus (PRV) infection and differentiate virulent and avirulent PRV, a duplex PCR method was established with two pairs of specific primers designed based on the conserved sequences of gE and gB genes of PRV.Optimize the reaction conditions by adjusting concentration of primers from 0.2 to 1.4 μL, each time adding 0.2 μL and temperature of annealing from 56 to 60 ℃, added 1 ℃ each time, and so on.The results showed that the suitable annealing temperature was 56 ℃ and the suitable primer dose was 1 μL.Two special fragments of 316 bp (PRV gE) and 432 bp (PRV gB) were amplified by the optimized duplex PCR.The specific tests showed that no PCR products were detected for PCV2, PTV, CSFV, PPV, PRRSV and E.coli.The sensitivity test showed that DNA used for the duplex PCR might be as low as 4.4×10³ copy/μL for PRV gE and 3.3×10³ copy/μL for PRV gB.The sensitivity of the duplex PCR was close to the single PCR.Fifty-six clinical samples of sick pigs from different areas in Guangdong and Guangxi province were detected by the duplex PCR and the virulent detection rate was 53.6% (30/56) for PRV and the negative rate was 46.4%(26/56), and there was no attenuated PRV infection.     

鉴别猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法的建立及初步应用

为了检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法。针对PRVgE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度(50~60℃,按照1℃递增)、引物浓度(0.2~1.4μL,依次增加0.2μL)的优化,结果表明,双重PCR反应的最佳退火温度为56℃、最适引物添加量为1μL。特异性试验结果表明,该方法可以扩增出PRVgE(316bp)和gB(432bp)的目的片段,对PCV2、PTV、CSFV、PPV、PRRSV、大肠杆菌的DNA或cDNA均无扩增。敏感性试验结果表明,PRVgE和gB的最低核酸检出量分别为4.4×10³和3.3×10³拷贝/μL,与单一PCR方法的敏感性相近。应用该方法对广东、广西地区临床送检的56份组织样品进行检测,检测结果显示,强毒感染阳性率为53.6%(30/56),阴性率为46.4%(26/56),未发现有弱毒感染。