猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明：建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10²～0.5×10⁶ copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。     

弓形虫LAMP荧光检测方法的建立与应用

为建立一种弓形虫环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法，以弓形虫高度重复性保守序列为模板，设计合成2组引物，对引物组进行比对和反应条件优化，确定特异性与灵敏度。结果表明，建立的方法在62℃50 min内对弓形虫的检测灵敏度为1 copies/μL,灵敏度高于行业标准(NY/T 573—2022),且优于市售的实时荧光定量PCR检测试剂盒，与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体均无交叉反应。应用LAMP荧光方法检测已知背景信息的200份弓形虫临床样品，检出阳性样品10份，阴性样品190份，检测结果与标准方法、荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP方法具有快速、灵敏度高、特异性强、仪器设备适用范围广等优点，适于在兽医实验室及动物医院推广应用。     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

一种快速检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光定量PCR方法

本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对，通过优化反应条件和反应程序，从而提高检测方法的灵敏性，并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测，并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明，基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对，能扩增2.2×10¹～2.2×10¹⁰copies·μL^-1的pMD18-I177L标准质粒，建立的标准曲线R²可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×10¹copies·μL^-1;该方法扩增反应采用一步法，耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增，但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增；用该方法对170份临床样品进行检测，本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS...     

致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(Vp_AHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的Vp_AHPND为副溶血弧菌变异株,下同) PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类Vp_AHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该Vp_AHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10¹拷贝/μL～8.3×10⁸拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I ...     

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10⁷拷贝/μL～1.43×10⁰拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检...     

马驽巴贝斯虫PCR和qPCR检测方法的建立

马驽巴贝斯虫是一种寄生于马属动物的血液原虫,给马产业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立两种高效、可靠的PCR诊断技术,为进一步提高口岸检疫工作效率奠定基础。根据马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计了一对特异性引物和荧光探针,建立了PCR和qPCR检测方法,测试了两种方法的特异性、灵敏性、稳定性。结果显示:建立的两种方法均具有良好的特异性;PCR方法的最低检出限为4.04×10² copies/μL,qPCR方法的最低检出限为4.04×10¹ copies/μL;对33份马血样品进行检测,结果qPCR检出的阳性样品数为23份(69.7%),而PCR检出的阳性样品数为9份(27.3%)。表明两种方法均可成功用于马驽巴贝斯虫的检验,但是荧光定量PCR方法的灵敏度明显优于PCR方法。     

牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10⁸～1×10¹拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R²=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10¹拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10³拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,...     

非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合，建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针，建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示，本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性，与其他常见猪病毒性原无交叉反应；同时，该方法具有较高灵敏度，p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为10²copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷，本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时，PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响；对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知，两者的灵敏度均为10² copies/μL;将多重PMA-q...     

鹅星状病毒、鹅细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV),根据GoAstV和GPV基因序列保守区域设计了两对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测这两种病毒的PCR诊断方法。该方法能够特异性扩增出两种病毒的相应片段,而对鹅副粘病毒(GPMV)、鹅流感病毒(GAIV)、鹅腺病毒(GADV)、鹅圆环病毒(GoCV)均无扩增,对重组质粒的最低检测拷贝数分别为1.25×10³ copies和1.25×10⁵ copies。应用该方法对50份鹅临床脏器样品进行检测,结果检测出GoAstV 35份、GPV 2份,GoAstV和GPV混合感染2份。结果表明,研究建立的双重PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于GoAstV和GPV的流行病学调查和疾病监测。     

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立

采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统，建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列，选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物，并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化，建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取10⁵～1 copies·μL^-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明，本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏，其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^-1)2.0μL、crRNA(100μmol·L^-1)3.2μL、TaqMan...     

禽源大肠杆菌荧光定量PCR方法的构建及应用

为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×10²～4.69×10⁹copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R²=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×10²copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。     

基于重组酶介导等温扩增技术的羊口疮病毒核酸检测方法的建立及初步应用

为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法，本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物，通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示：该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测，结果显示：该方法除对ORFV的检测结果为阳性外，对羊的其他病毒的检测结果均为阴性，特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×10⁹拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)后为模板，利用本研究建立的RAA方法检测，结果显示：该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×10⁴拷贝/μL，敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测，结果显示：该RAA方法能够对临床样品快速检测，组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80)，该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为...     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10³～10⁴倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法，根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针，通过优化反应条件，建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示，该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10⁹—1.019×10²copies/μL时，相关系数R²为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系；与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应，最低检测限度为10.19 copies/μL，组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测，两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20)，两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明，本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。     

基于胞内劳森菌16S rDNA基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank发表的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)基因组16SrDNA序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,以L.intracellularis疫苗核酸为模板,建立L.intracellularis TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对该检测法制作了标准曲线,并进行了特异性、敏感性和重复性试验,并将其应用于猪增生性肠炎诊断。结果表明,所建立的TaqMan实时荧光定量方法特异性强,仅对含有L.intracellularis扩增出S型荧光曲线,而对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等均无扩增;该方法在1.2×102¹.2×108 copies/μL有良好的线性关系,相关系数为0.972;最低检测浓度为10copies/μL,重复性良好。对79份临床样品检测表明,该方法灵敏度高于普通PCR方法,可用于猪增生性肠炎的临床诊断。     

猪流行性腹泻病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，本研究根据PEDV ORF1a/b基因的保守序列，设计了8组特异性引物，以PEDC cDNA为模板，采用试剂盒推荐的各反应条件经LAMP扩增，根据LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果筛选最佳引物组。以筛选的外引物PE2 F3/B3经PCR从PEDV cDNA中扩增ORF1a/b基因，构建重组质粒p PE-ORF1-2并分别经PCR和测序鉴定。结果显示，2号引物组(内引物PE2 FIP/PE2 BIP，外引物PE2 F3/PE2 B3)为最佳引物。PCR和测序鉴定结果表明重组质粒正确构建，经计算其浓度为1.56×1011拷贝/μL，将其稀释1 000倍后作为质粒标准品。为建立检测PEDV的RT-LAMP方法，本研究对该方法的反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内、外引物及d NTP浓度进行了优化，结果显示，RT-LAMP反应体系为：60℃反应50 min,Mg2+浓度80 mmol/L，内外引物终浓度分别为32μmol/L和5μmol/L,d NTP浓度10 mmol/L；通过在上述体系中加入甲酚红指示...     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。