紫菜种内原生质体的融合和融合体再生

利用酶解法分离出野生型叶状体和红色突变体的坛紫菜原生质体以及条斑紫菜野生型叶状体的原生质体，再用聚乙二醇（PEG）法进行种内原生质体融合，当加入原生质体液内的PEG被稀释除去百，原生质体发生融合并形成许多杂合体，种内原生质体融合率坛紫菜为9.7%-12.4%，条斑紫菜为10%-11.5%。PEG分子量在1540-6000之间，随着分子量的提高，原生质体融合率增高，原生质体融合体被挑出来进行单个培养，经过30天培养坛紫菜的一个杂合体（含一个红色原生质体和一个进驻生型原生质体）再生成一个呈红色和野生色的相嵌叶状体，鸸 个含两个红色原生质体的融合体再生成一个在基部和头部均长假根的叶状体，但来自这个再生体的原生质体只长成具有一个假根的叶状体，从原生质体融保体的再生体以及它们无性繁殖体的结果来看，坛紫菜的种内原生质体融合体可能只发生了细胞质融合，而真正的核融合并没有发生，培养15-20天，条斑紫菜的原生质体融合体先再生成细胞团，然后由细胞团释放出许胞子并萌发成正常野生型叶状体。     

紫菜种内原生质体的融合和融合体再生

利用酶解法分离出野生型叶状体和红色突变体的坛紫菜原生质体以及条斑紫菜野生型叶状体的原生质体，再用聚乙二醇（PEG）法进行种内原生质体融合，当加入原生质体液内的PEG被稀释除去百，原生质体发生融合并形成许多杂合体，种内原生质体融合率坛紫菜为9.7%-12.4%，条斑紫菜为10%-11.5%。PEG分子量在1540-6000之间，随着分子量的提高，原生质体融合率增高，原生质体融合体被挑出来进行单个培养，经过30天培养坛紫菜的一个杂合体（含一个红色原生质体和一个进驻生型原生质体）再生成一个呈红色和野生色的相嵌叶状体，鸸 个含两个红色原生质体的融合体再生成一个在基部和头部均长假根的叶状体，但来自这个再生体的原生质体只长成具有一个假根的叶状体，从原生质体融保体的再生体以及它们无性繁殖体的结果来看，坛紫菜的种内原生质体融合体可能只发生了细胞质融合，而真正的核融合并没有发生，培养15-20天，条斑紫菜的原生质体融合体先再生成细胞团，然后由细胞团释放出许胞子并萌发成正常野生型叶状体。     

原生质体融合选育高产多糖的罗尔阿太菌菌株

【目的】选育罗尔阿太菌多糖高产、草酸低产的优良罗尔阿太菌菌株.【方法】采用原生质体融合技术,以罗尔阿太菌菌株AY6657741为原始菌株,以紫外和亚硝基胍复合诱变的2株多糖高产的诱变株Ar-1和Ar-2为双亲菌株;通过正交试验优化原生质体的制备条件.【结果和结论】5.56 mmol·L^-1 的β-巯基乙醇处理菌悬液,0.4 mol·L^-1的 KCl作为渗透压稳定剂, 3.1 mg·mL^-1 的复合酶液（纤维素酶φ为2%、蜗牛酶φ为2%、溶壁酶φ为4%）,pH 5.5,32 ℃酶解55 min,原生质体形成率93.534%,再生率18.921%.0.4 g·mL^-1 的聚乙二醇6000在30 ℃条件下融合25 min,选育出1株多糖高产、草酸低产的菌株,命名为AY-3.菌株AY-3多糖产量达24.673 g·L^-1,比原始菌株AY6657741的产糖量提高了54.42%,草酸质量浓度降低至0.281 g·L^-1,比原始菌株草酸的质量浓度降低了43.57%.     

聚乙二醇法诱导烟草原生质体融合的条件优化

采用聚乙二醇(PEG)法诱导烟草原生质体融合,对融合时PEG的浓度、用量、融合时间及融合温度进行优化,以期得到一种融合率较高的方法。结果表明:以40%的PEG融合的二元融合率最高;PEG与原生质体悬浮液体积比为3∶5,在0.5～0.6 mol/L甘露醇为渗透压时,25～30℃下融合20～25 min的融合效果最佳,融合率始终保持在20%左右,甚至可达25%。     

芦荟原生质体融合的研究

以芦荟叶片为试材,采用酶解方法进行原生质体分离,并在此基础上对斑纹芦荟和不夜城芦荟进行原生质体融合。结果表明,以芦荟的叶肉细胞为试材,可成功分离出原生质体,而且活力较高,达90%以上。聚乙二醇（PEG）融合的结果可获得部分融合体。芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成,另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值等影响。融合的效率主要受融合剂的浓度、原生质体的生理状态及处理的时间等影响。     

影响微生物原生质体融合技术的因素

原生质体融合技术是微生物育种的有效方法之一，包括原生质体制备、原生质体融合、原生质体再生及融合子的分离等主要过程。综述了培养基成分、菌龄、酶的种类及浓度、稳定剂、PEG的分子量、浓度等因素对微生物原生质体制备、融合及再生的影响，并对近年来国内外学者在微生物原生质体融合技术及应用方面所取得的最新进展进行了概括。     

何首乌叶原生质体制备与融合研究

[目的]研究何首乌叶片原生质体的制备和融合方法。[方法]用机械法制备何首乌叶片的原生质体,用PEG结合高Ca2+-高p H诱导融合法来诱导其原生质体,研究原生质体的融合现象。[结果]何首乌叶片在25℃和35%的蔗糖溶液中处理30 min能够制备出较多的完整原生质体。用20%PEG融合液处理原生质体20min能够有效地诱导何首乌原生质体的融合,2个细胞的融合效率为11.7%,表明用机械法制备的原生质体也是有活性的。[结论]该技术为何首乌原生质体培育奠定了基础。     

原生质体融合技术对秦岭霉素产量提高的影响

 【目的】对No.24菌株及其诱变株Ms-24菌株的原生质体的制备、融合、再生条件及融合子的生物活性进行了研究，探索了秦岭霉素的产量提高与融合条件的关系。【方法】采用荧光染色技术对融合子进行了标记，秦岭霉素含量的测定采用了HPLC法进行。【结果】融合后得到的3株高产秦岭霉素的融合子即为pf77，pf126和pf138菌株，其发酵产物的杀菌活性比原始No.24菌株分别提高了43.48％，60.87％和65.22％。HPLC检测发现，融合子pf77，pf126，pf138菌株发酵产物中秦岭霉素的含量与No.24菌株相比分别提高了36.59％，74.39％和91.46％。【结论】进行原生质体再生时，添加甘氨酸、溶菌酶的浓度要适中；原生质体融合时，酶解时间、聚乙二醇（PEG）的浓度和分子量也要适宜。     

甘蓝与大白菜的原生质体融合

[目的]研究两种近缘物种原生质体的最佳融合条件。[方法]利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素酶的作用下分离出原生质体,再利用PEG融合液将这2种原生质体融合。[结果]用6％甘露醇＋8％纤维素酶＋2％果胶酶处理材料,酶解4h后,可以获得大量的游离原生质体,大部分原生质体呈圆形,散乱地游离在原生质体溶液各处。利用30％PEG融合液及0．1mol／LCaCI：溶液（含9％甘露醇,pH值9．5）将这两种原生质体融合可以获得稳定的、可育的细胞杂种植株,可以直接作为育种的种质材料。[结论]该研究为远缘杂交和进一步研究原生质体的培养及再生奠定了基础。     

生防链霉菌ML27和柑橘内生放线菌P3Y2原生质体融合研究

为了将生防链霉菌ML27和柑橘内生放线菌P3Y2的优良特性整合在一起,对两株菌进行了原生质体融合研究。结果表明,菌株ML27和P3Y2的种子液分别转移到蔗糖浓度为20%和10%以及甘氨酸浓度为1.5%和1.0%的培养液中培养,收获的菌丝体对原生质体形成和再生最有利;分别选用5 mg/m L、90 min,及5 mg/m L、120 min的溶菌酶浓度与酶解时间制备ML27与P3Y2的原生质体能达到较高的形成率和再生率;在60℃条件下,菌株ML27和P3Y2的原生质体热灭活时间分别以10 min和15 min适宜;在20 W紫外灯下15 cm处分别照射7 min和5 min时,菌株ML27和P3Y2原生质体的灭活程度适宜。在此基础上,进行菌株ML27和P3Y2的原生质体融合,根据形态学特征、抑菌活性检测和定殖能力测定初步筛选出1株融合菌株MP45。试验结果可为这两株柑橘病害生防菌株的改良和充分利用奠定基础。     

融合及培养条件对甘蓝和萝卜原生质体融合及细胞分裂的影响

探讨了融合液、原生质体密度及不同品种对原生质体融合效果的影响。在融合液中加入0.5mol/L甘露醇和1mmol/LCaCl·22H2O可以有效提高融合率。1×105/mL的原生质体密度可以得到较高的二体融合率。不同品种对融合率影响不大,但对细胞分裂率有较大影响。     

野燕麦原生质体制备和融合的研究

[目的]研究野燕麦原生质体的制备与融合方法.[方法]用机械法制备野燕麦的原生质体,并用PEG结合高Ca2＋-高pH溶液的融合法对原生质体的融合进行研究.[结果]野燕麦叶片在35％蔗糖溶液中质壁分离15 min能够制备数量较多的原生质体;PEG结合Ca2-高pH融合法能有效地使野燕麦原生质体融合.[结论]该技术为植物叶片细胞原生质体的制备与融合奠定了基础.     

灵武长枣果酒酿酒酵母与红酵母原生质体融合的研究

筛选酿酒酵母菌,并将其原生质体与红酵母原生质体进行融合,以期获得优良融合子.首先,从灵武长枣果皮上筛选分离出一株性能优良的酿酒酵母(YLLJ),然后用溶菌酶与蜗牛酶对其与红酵母菌的细胞壁进行酶解,制成原生质体,将两亲本原生质体按数量比1:1混合后,在促融合剂PEG作用下进行融合,融合子在高渗培养基上培养呈现黄色,既有酿酒能力又能产类胡萝卜素.     

溶藻细菌F8与藻毒素降解菌T1的原生质体融合研究

为制备出兼具溶藻及降解藻毒素(MC-LR)的双效工程菌,研究不同的亲本原生质体灭活方式、不同PEG浓度、pH以及作用的温度对原生质体融合的影响,探讨溶藻细菌F8与藻毒素降解菌T1菌株的原生质体融合的适宜条件。结果表明,对F8菌株的原生质体采用45℃热灭活、T1菌株的原生质体紫外灭活,采用pH为8.0的30%的PEG溶液,融合温度为30℃,原生质体融合率可达28.17%。     

亚麻与红麻的原生质体融合

将亚麻与红麻的愈伤组织在水解酶的作用下分离出原生质体,然后利用PEG法使这2种原生质体融合。结果表明,用2%纤维素酶+1%果胶酶+0.55mol/L甘露醇处理材料,酶解6h后,可以获得大量游离的、圆球形的原生质体;利用40%PEG6000及0.3mol/LCaCl2溶液(含9%甘露醇,pH9.5)将这2种原生质体融合,可以获得稳定的杂合细胞。     

双亲灭活原生质体电诱导融合法选育高漆酶活性菌株

以杏鲍菇和平菇为亲本菌株,采用双亲灭活原生质体融合技术选育高漆酶活性且遗传稳定的融合菌株。结果表明:杏鲍菇原生质体采用紫外灭活,在30 W紫外灯、照射距离30 cm条件下处理20 min,灭活率达100%。平菇原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%。两菌株按1∶1混合,施加1 MHz、250 V/cm的成串脉冲电压,5.5 kV/cm的融合脉冲电压的电场诱导下使其电融合,原生质体成对率达到70%,融合率为3.2×10-3。从147株融合菌株中筛选出1株高漆酶活性菌株F49,其漆酶和TTC-脱氢酶酶活比双亲分别提高20.6%和25.3%,遗传稳定性分别达到92.0%和92.7%以上。从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、拮抗试验等方面对融合子进行鉴定,证实为具有双亲性状的融合株。     

原生质体融合选育耐高温耐盐红螺菌的研究

为选育耐高温耐盐红螺菌用于其粉状制剂研制,以降解水产养殖水体亚硝基氮功能达90%以上的耐盐红螺菌与能在60～70℃下生长的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌株,通过正交试验探讨2种菌株的原生质体融合条件。分别对融合子进行温度、生长盐度和净化水质等功能测定,检出性能较优的融合子,同时采用电镜、细胞色素吸收光谱等方法,将融合子优良株与2种亲株进行比较鉴别。实验结果表明,2种菌株原生质体融合的最优条件为温度37℃,作用时间3 h,聚乙二醇(PEG)浓度为40%。在该优化条件下原生质体融合率为1.536%,筛选获得3株能在30～50℃良好生长的融合子(a、b、c)。融合子生长耐受温度较耐盐红螺菌亲株提高66%,但耐受盐度、降解养殖水体氨氮与亚硝基氮功能均与耐盐红螺菌亲株相近。其中融合子a菌株具有生长更快、性能更稳定的特点,其细胞形态特征、革兰氏染色属性、色素吸收峰等均与耐盐红螺菌相似。     

原生质体融合选育耐高温耐盐红螺菌的研究

为选育耐高温耐盐红螺菌用于其粉状制剂研制,以降解水产养殖水体亚硝基氮功能达90%以上的耐盐红螺菌与能在60～70 ℃下生长的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌株,通过正交试验探讨2种菌株的原生质体融合条件。分别对融合子进行温度、生长盐度和净化水质等功能测定,检出性能较优的融合子,同时采用电镜、细胞色素吸收光谱等方法,将融合子优良株与2种亲株进行比较鉴别。实验结果表明,2种菌株原生质体融合的最优条件为温度37 ℃,作用时间3 h,聚乙二醇（PEG）浓度为40%。在该优化条件下原生质体融合率为1.536%,筛选获得3株能在30～50 ℃良好生长的融合子（a、b、c）。融合子生长耐受温度较耐盐红螺菌亲株提高66%,但耐受盐度、降解养殖水体氨氮与亚硝基氮功能均与耐盐红螺菌亲株相近。其中融合子a菌株具有生长更快、性能更稳定的特点,其细胞形态特征、革兰氏染色属性、色素吸收峰等均与耐盐红螺菌相似。     

曲霉种间原生质体融合改良产淀粉酶能力的研究

原生质体制备与融合是重要的细胞工程技术,有利于实现远缘遗传物质的直接交换,促进遗传资源创新。本试验用Olympus BHS显微镜观察了曲霉原生质体融合全过程;采用淀粉-麸皮-硫铵培养基、淀粉-麸皮-豆粕培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)等研究曲霉融合子及亲株产淀粉酶能力的特点;比较分析了亲株和融合子产淀粉酶性能与温度稳定性;比较研究了曲霉亲株和融合子淀粉酶的淀粉-聚丙烯酰胺非变性垂直平板凝胶电泳特征和各菌株可溶性蛋白质的淀粉-聚丙烯酰胺凝胶电泳特征。结果表明:曲霉原生质体融合过程很快,整个融合过程在5 min之内完成;融合子及亲株产淀粉酶随培养基、培养时间不同而变化;F05融合子在淀粉-麸皮-豆粕培养基产酶水平达(61 111.42±123.30)U/g,比亲株M70和M4分别高204.81%和114.00%,耐高温性能也有所提高;2种电泳结果都能够特异性显示淀粉酶带、重复性好。可见,原生质体融合是改良曲霉淀粉酶的有效方法。     

不同虫生曲霉原生质体融合选育松墨天牛高毒力菌株

采用紫外或加热方法分别对虫生曲霉天牛生葡萄曲霉（Aspergillus vitis）和叶甲生烟曲霉（Aspergillus fumigatus var fumigatus）的原生质体分别进行灭活,然后对灭活双亲用PEG6000作融合剂进行原生质体融合。将融合子第2、第4、第6和第8代的菌落和分生孢子梗特征进行比较后,选出5株生长速度快、生产孢子多的融合株进行胞外蛋白酶的检测和松墨天牛幼虫毒力测试。结果发现,融合株U4-2对松墨天牛幼虫的死亡百分率为73.3%,和2个亲本相比较显著增强了毒力。