双亲灭活原生质体电诱导融合法选育高漆酶活性菌株

以杏鲍菇和平菇为亲本菌株,采用双亲灭活原生质体融合技术选育高漆酶活性且遗传稳定的融合菌株。结果表明:杏鲍菇原生质体采用紫外灭活,在30 W紫外灯、照射距离30 cm条件下处理20 min,灭活率达100%。平菇原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%。两菌株按1∶1混合,施加1 MHz、250 V/cm的成串脉冲电压,5.5 kV/cm的融合脉冲电压的电场诱导下使其电融合,原生质体成对率达到70%,融合率为3.2×10-3。从147株融合菌株中筛选出1株高漆酶活性菌株F49,其漆酶和TTC-脱氢酶酶活比双亲分别提高20.6%和25.3%,遗传稳定性分别达到92.0%和92.7%以上。从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、拮抗试验等方面对融合子进行鉴定,证实为具有双亲性状的融合株。     

双亲灭活原生质体融合技术在草菇耐低温菌株选育上的应用

为了选育耐低温草菇菌株,以草菇V23、V3552为亲本,采用酶解法制备原生质体,用紫外诱变、化学诱变两种方法对草菇菌株进行诱变,筛选到耐低温的突变株;然后利用紫外灭活（20 W,30 cm,110 s）和热灭活（50℃ 3 min）的双亲灭活标记法对突变株进行化学融合,结果表明在400 g/L的PEG6000、pH 8.0、融合时间30 min和融合温度32℃的条件下融合率最高,达到0.517%, 共获得200个融合子。经过0℃低温筛选,最终获得15株草菇耐低温菌株,菌丝在0℃的耐冻能力提高了4.5倍。经出菇实验证明其子实体与出发菌株相比具有明显的耐低温性,液化现象明显推迟,说明该方法筛选出的菌株具有进一步应用开发的价值。     

一株铜绿微囊藻溶藻菌的分离鉴定和溶藻特性

以铜绿微囊藻为溶解对象,从富营养化水体中分离到1株溶藻菌H1,通过形态特征及16S rDNA序列分析,该菌株属寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.),GenBank登录号为KU359254。探讨了菌株H1对铜绿微囊藻(FACHB-1326)的溶藻方式,菌藻浓度、菌的生长时期及光照、pH、温度等环境因子对铜绿微囊藻溶藻效果的影响。结果表明,菌株H1溶藻方式主要是间接作用溶藻。处于对数期的菌株H1抑藻效果最高,溶藻率达77.9%;菌液浓度达10~8 CFU·mL~(-1)以上,溶藻率最高,为81.8%;在pH7、30℃条件下,活性较强;pH7时30℃条件下,溶藻率为72.5%,63.2%;菌株H1对微囊藻生长的抑制效果是全黑条件光循环条件全光条件,全黑条件下溶藻率最高为59.9%。     

种间杂交选育新型产脂蛹虫草

为选育能够合成虫草素又能高效积累油脂的新型蛹虫草菌株,将高产虫草素的蛹虫草FY1421及高效合成油脂特别是不饱和脂肪酸的深黄被孢霉菌株Z0108进行原生质体融合。对亲本的原生质体的形成与再生、双亲灭活及融合的条件进行了筛选与优化,并结合96微孔板初筛和摇瓶发酵复筛,获取融合子。结果表明:蛹虫草菌株FY1421采用1. 5%溶壁酶+0. 5%蜗牛酶+0. 5%纤维素酶的混合酶液处理120 min,原生质体数量最多,再生率最高;深黄被孢霉菌株Z0108采用1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶的混合酶液处理4 h,原生质体数量最多,再生率最高; FY1421原生质体采用60℃水浴热灭活10 min,Z0108原生质体采用紫外线灭活30 s,均可达到100%的灭活率;灭活双亲在35℃下,使用40%的PEG促融10 min,融合效率最高。从650株融合子筛选得到融合菌株RCS262,其摇瓶发酵虫草素含量达5 926μg·g~(-1),油脂含量达到37. 5%。采用原生质体融合技术进行蛹虫草与深黄被孢霉的种间杂交,成功获得融合菌株既能高产虫草素,也具有高效积累油脂的能力。     

阿特拉津降解融合子的原生质体制备及其筛选

以吉林省玉米带黑土中的优势真菌黑曲霉(A-02-10)为受体,阿特拉津降解菌青霉(P-02-07)的灭活原生质体为供体,对利用原生质体融合技术将降解基因导入土壤微生物优势种细胞,进而提高阿特拉津降解菌在土壤中定殖能力的可行性进行了初步研究.结果表明:(1)通过原生质体融合技术可显著提高阿特拉津降解菌在土壤中的定殖能力和降解效果,筛选出的融合子A1在自然土壤中的定殖数量可维持在6.4×106CFU·g-1,使土壤中阿特拉津降解的半衰期由亲本(青霉P-02-07)的30 d,缩短为10 d.(2)供试的2个亲本具有相似的原生质体制备条件,即供试菌株的原生质体制备溶壁酶(Lywallzyme)浓度为2.0%～2.5%,最适酶解温度为30℃,酶解时间为5 h,酶解液的pH值为6.0～6.5.此外,还讨论了单亲灭活原生质体融合技术在农药降解菌筛选中的独特技术优势--无需对菌株进行抗性标记,完全可以通过用农药配制的选择性培养基,依据菌落特征和农药溶解圈进行融合子的筛选,其中由农药配制而成的选择性培养基不仅可以用于降解融合子的定性筛选,而且还可以用于降解融合子在土壤中定殖数量的动态描述.原生质体融合技术仍是现阶段最为现实可行,最易广泛开展并收到实效的生物工程技术手段,通过原生质体融合进行基因体内重组构建具有降解优势基因工程菌的生物技术手段,应重新得到人们广泛关注.     

生防放线菌原生质体融合条件的研究

利用重寄生链霉菌F46与生防放线菌SC1和SC11进行原生质体融合,以原生质体的形成率和再生率为指标,研究了Gly、蔗糖、酶及其质量浓度对原生质体融合的影响,并确定了最佳的酶解时间及灭活时间。结果表明,3个菌株培养液中加入Gly和蔗糖的质量浓度以0．5和30 g／mL为宜。对菌株SC1和SC11,分别用10 mg／mL和15 mg／mL,溶菌酶酶解60 min和100 min较合适;对菌株F46,以蜗牛酶(10 mg／mL)和溶菌酶(10 mg／mL)体积比为1:1的混合酶液酶解75 min为宜。菌株F46在55℃条件下热灭活45 min,菌株SC1和SC11则需在55℃条件下热灭活15 min;菌株F46,SC1和SC11的紫外灭活时间分别为16,2和3 min。     

一株水华鱼腥藻溶藻菌的分离鉴定及菌藻关系初探

[目的]研究溶藻特性及菌藻关系,为进一步研究溶藻细菌对水华的治理作用提供帮助。[方法]从富营养化水体中分离得到一株有高效溶藻效果的菌株（S7）,研究了其对水华鱼腥藻（Anabaena flosaquae）的抑制效果、作用方式和不同环境因子对溶藻效果的影响,以及菌藻关系,并对菌株进行了菌体Poly-p染色、革兰氏染色和分子鉴定。[结果]菌株投加量为藻液量的30%时,7 d叶绿素a的去除率达到90%以上。pH为9、温度35℃下藻的去除率最高。S7菌株与水华鱼腥藻形成竞争共栖的生态关系,并通过分泌溶藻物质间接抑制水华鱼腥藻生长,且该物质具有一定的热稳定性。根据生理生化及16S rDNA序列分析鉴定,S7属于金黄杆菌属（Chryseobacteriumsp.）。[结论]该菌对水华鱼腥藻有较强的溶藻效果,且为聚磷菌。     

一株水华鱼腥藻溶藻菌的分离鉴定及菌藻关系初探(英文)

[目的]研究溶藻特性及菌藻关系,为进一步研究溶藻细菌对水华的治理作用提供帮助。[方法]从富营养化水体中分离得到一株有高效溶藻效果的菌株(S7),研究了其对水华鱼腥藻(Anabaena flosaquae)的抑制效果、作用方式和不同环境因子对溶藻效果的影响,以及菌藻关系,并对菌株进行了菌体Poly-p的染色、革兰氏染色和分子鉴定。[结果]菌株投加量为藻液量的30%时,7d叶绿素a的去除率达到90%以上。pH为9,温度35℃下藻的去除率最高。S7菌株与水华鱼腥藻形成竞争共栖的生态关系,并通过分泌溶藻物质间接抑制水华鱼腥藻生长,且该物质具有一定的热稳定性。根据生理生化及16SrDNA序列分析鉴定,S7属于金黄杆菌属(Chryseobacterium)。[结论]该菌对水华鱼腥藻有较强的溶藻效果,且为聚磷菌。     

原生质体融合选育耐高温耐盐红螺菌的研究

为选育耐高温耐盐红螺菌用于其粉状制剂研制,以降解水产养殖水体亚硝基氮功能达90%以上的耐盐红螺菌与能在60～70℃下生长的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌株,通过正交试验探讨2种菌株的原生质体融合条件。分别对融合子进行温度、生长盐度和净化水质等功能测定,检出性能较优的融合子,同时采用电镜、细胞色素吸收光谱等方法,将融合子优良株与2种亲株进行比较鉴别。实验结果表明,2种菌株原生质体融合的最优条件为温度37℃,作用时间3 h,聚乙二醇(PEG)浓度为40%。在该优化条件下原生质体融合率为1.536%,筛选获得3株能在30～50℃良好生长的融合子(a、b、c)。融合子生长耐受温度较耐盐红螺菌亲株提高66%,但耐受盐度、降解养殖水体氨氮与亚硝基氮功能均与耐盐红螺菌亲株相近。其中融合子a菌株具有生长更快、性能更稳定的特点,其细胞形态特征、革兰氏染色属性、色素吸收峰等均与耐盐红螺菌相似。     

玫烟色棒束孢IfB01菌株原生质体制备与转化条件研究

为了提高虫生真菌玫烟色棒束孢If B01原生质体的产量和转化效率,进而为该菌株的基因工程和细胞工程改良奠定基础,本文研究了不同细胞壁降解酶配比、渗透压稳定剂、酶解温度、时间、p H值和转速等对玫烟色棒束孢If B01原生质体制备以及不同聚乙二醇4000(PEG4000)浓度对原生质体转化的影响。结果显示,培养30 h的菌丝用1%蜗牛酶+2%纤维素酶配比、以0.7 mol/L的Na Cl溶液(p H6.0)为渗透压稳定剂,30℃、100 r/min酶解8 h,获得的原生质体产量最高,达6.72×106个/m L;此原生质体在40%的PEG4000作用下可获得最高的转化效率,达7.05%。研究表明酶液、酶解温度、时间、p H值、渗透压、稳定剂、转速和PEG4000的浓度等因素对原生质体的制备和转化有较大影响。     

聚乙二醇法诱导烟草原生质体融合的条件优化

采用聚乙二醇(PEG)法诱导烟草原生质体融合,对融合时PEG的浓度、用量、融合时间及融合温度进行优化,以期得到一种融合率较高的方法。结果表明:以40%的PEG融合的二元融合率最高;PEG与原生质体悬浮液体积比为3∶5,在0.5～0.6 mol/L甘露醇为渗透压时,25～30℃下融合20～25 min的融合效果最佳,融合率始终保持在20%左右,甚至可达25%。     

利用原生质体融合技术构建植酸酶、纤维素酶枯草芽孢杆菌工程菌的研究

以产植酸酶枯草芽孢杆菌(A5)复合诱变的再生突变株Z56和产纤维素酶枯草芽孢杆菌(B6)复合诱变的再生突变株X57为亲本,利用双亲灭活原生质体融合技术进行种内融合,构建可同时产植酸酶、纤维素酶的工程菌。结果表明,从构建的385个融合子中筛选到6株两种酶活性相对较高的工程菌,其中R4、R5的纤维素酶产量高于亲本,植酸酶产量也相对较高;粗酶液用90℃处理10min后,纤维素酶剩余酶活分别为对照的62%和58%,植酸酶剩余酶活分别为对照的73%和71%。     

Screening of Feather Degrading Bacteria and Optimization of Fer-mentation Conditions from Poultry

The purpose of this experiment was to isolate and screen the microorganisms from the soil where chicken feathers were piled for a long time and identify them biologically. Single-factor test and response surface methodology (RSM) analyses were used to explore the optimum conditions for the growth and fermentation of a strain. Screening of bacterial strains from the soil where feathers were piled for a long time was performed, and 12 keratinolytic bacterial strains were isolated. One of these isolates, CH-7, was found to be the most effective feather-degrading strain, which was identified as Lactococcus lactis KU568489.1. The growth situation of feather keratin degrading bacterium analysis results showed that the best degradation effect of CH-7 was found in oxygen, inoculation 5％, initial pH=6.5, fermentation temperature 30℃, speed 220 r ? min-1 and fermentation time 36 h, and CH-7 had the highest degradation rate of feather keratin. The optimization analysis of RSM showed that there was more significances of the three factors, 32℃, pH 6.3 and amount of inoculum at 5.7％ on the degradation of feather keratin. Based on the above results, the feather degrading bacterium, Lactococcus lactis CH-7, was obtained by screening, 30℃ and pH 5.5-6.5 were the best growth conditions. The oxygen, the amount of inoculum 5.7％, the fermentation temperature, 32℃, pH 6.3 and the rotational speed 220 r ? min-1 were the best fermentation conditions. Under these conditions, 38.48％ degradation rate was obtained after 36 h fermentation, which demonstrated the strain CH-7 was potential to the fermented feather meal for feed.     

采用原生质体融合技术选育提高氨氮降解效能的光合细菌

将高效降解氨氮的假丝酵母菌Candida sp.与高效降解亚硝酸盐氮的耐盐红螺菌Rhodospeudomonas capsulate进行原生质体融合,探讨原生质体制备及融合的条件,并对融合子进行了筛选。结果表明,原生质体制备的优化条件如下：耐盐红螺菌,溶菌酶量为1.5 mg/mL,EDTA浓度为0.1 g/L,作用时间为45min;假丝酵母菌,蜗牛酶量为0.5 mg/mL,巯基乙醇的质量分数为0.1%,EDTA浓度为1 g/L,作用时间为30 min。两种原生质体在聚乙二醇（PEG-6000）和Ca2＋的诱导下发生融合,在添加制霉菌素和链霉素的选择培养基上进行初筛,以生长稳定性及对氨氮、亚硝酸盐氮的降解效能等为指标进行复筛,获得了具有较好降解效能的融合子R1菌株。该菌株对亚硝酸盐氮的降解效能与耐盐红螺菌相同,达到90%以上;对氨氮的降解效能为63%,较耐盐红螺菌提高54%。     

光合细菌培养条件的研究

对光合细菌(PSB)培养的最适光照、温度、pH值、最佳接种量等条件进行了系统研究,结果表明:PSB生长环境的光照强度越大,生长速度越快,生物量也越大;其最适生长温度为30℃,最适pH值为7.5～8.5,最佳接种量为20%。     

阿维链霉菌原生质体制备方法的研究

对阿维链霉菌原生质体制备进行了研究,结果表明:阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为在35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培养基中接种孢子悬液,28℃、200 r/min培养40 h;3 000 r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/mL的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50 min完成原生质体制备。以50%PEG1000为促融剂,原生质体融合率最高。     

肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌融合子的构建

为探索鱼类病原菌融合疫苗制备的可行性,以肠型点状气单细胞菌58-20-9菌株和鱼害粘球菌G4菌株作为初发菌株进行原生质体融合,构建融合子.在酶解温度37℃下,筛选出最适酶解时间为40min,最适溶菌酶质量浓度为4mg/mL.以PEG为促融剂的条件下,58-20-9菌株与G4菌株的原生质体进行了融合,58-20-9菌株的原生质体形成率为54.7%,原生质体再生率为18.2%,G4菌株的原生质体形成率为50.8%,原生质体再生率为12.2%,初筛的原生质体融合率为4‰.点种500个初筛融合子菌落在双抗培养基上连续传代12次,得到1个稳定的融合子菌落,其稳定率为0.2%.     

解磷菌的降解能力及其培养特性的研究

采用限制性培养的方法从大庆多年耕作的农田土壤中分离筛选出的无机磷降解菌1株。在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的平板培养中对其解磷能力进行测定,结果能观察到溶磷圈,但溶磷圈直径较小;在液体培养法中利用钼锑抗比色法对其解磷能力进行测定,在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养液中的可溶性磷得率为10.01%,解磷能力较强。通过研究不同初始pH、温度、气液比对解磷能力的影响,确定分解Ca3(PO4)2的最佳条件为30℃,180r/min,pH7～8。气液比越小越有利于溶磷。     

4株降TSNAs细菌菌株的培养条件优化研究

[目的]探究4株降烟草特有亚硝胺(TSNA)内生细菌WB3、TRM、WB6、WB7的最佳培养条件。[方法]试验通过选用不同的培养基,设置时间、温度、pH梯度,测定不同培养条件下菌液的生长情况,得出4株细菌菌株最适宜培养的优化条件组合。[结果]试验表明,WB3的最佳培养基为LB,最佳培养时间为30～42 h,最适培养温度为25～28℃,最适pH为6.0;TRM的最佳培养基为LB,最佳培养时间为24～30 h,最适培养温度为25～28℃,最适pH为8.0;WB6的最佳培养基为LB,最佳培养时间为30～42 h,最适培养温度为28～31℃,最适pH为9.0;WB7的最佳培养基为LB,最佳培养时间为30～36 h,最适培养温度为31～34℃,最适pH为8.0。[结论]研究可为菌株的进一步应用提供科学的参考依据。