不同品种猪PVALB基因多态性及其在肌肉组织的表达差异分析

为探究小白蛋白（PVALB）基因在藏猪和大约克猪上的单核苷酸多态性（SNP）位点及在不同品种猪腿肌、背最长肌中的表达规律，以30、90、180日龄的藏猪和大约克猪作为试验对象，对藏猪和大约克猪PVALB基因起始密码子上游2 000 bp区域DNA序列进行SNP筛选与基因分型，利用实时荧光定量PCR技术检测PVALB基因在腿肌和背最长肌中的差异表达情况。结果显示，PVALB基因起始密码子上游2 000 bp区域存在2个SNP位点G1659C和C1269T，且均符合哈迪-温伯格定律（P>0.05）；预测转录因子结果显示，G1659C和C1269T突变位点导致NRF2、NCOR1转录因子结合位点消失，新增与肌肉生长和细胞分化有关的NR1D1和OTX2转录因子结合位点；PVALB基因在藏猪及大约克猪腿肌和背最长肌中mRNA相对表达量趋势基本一致，在30日龄和90日龄，大约克猪背最长肌PVALB基因表达量极显著高于藏猪（P<0.01），在180日龄时显著高于藏猪（P<0.05）。综上，PVALB基因表达可能与肌肉的生长发育呈正相关，同时PVALB基因可作为骨骼肌早期发育和肉质性...     

Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度（0、50、100和200 μmol∙L^-1）的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链（MyHC）的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示,50和100 μmol∙L^-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组（P<0.05）;CCK8测得50和100 μmol∙L^-1 Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组（P<0.05）;100和200 μmol∙L^-1的Trolox显著上调了PAX7的表达（P<0.05）,对PAX7蛋白的表达有上调趋势,但无显著差异（P>0.05）;添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低（P<0.001）;在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调（P<0.05）,而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化（P>0.05）;免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异（P>0.05）。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。     

TETs与细胞程序性死亡相关基因在山羊妊娠早期输卵管及子宫角的表达

【目的】TET（ten-eleven translocation）家族蛋白在调控胚胎和胎盘发育等过程中具有重要作用,输卵管与子宫内膜细胞的死亡平衡会影响受精卵及早期胚胎的发育。因此探讨TETs、细胞程序性死亡相关基因和附植相关基因在妊娠早期山羊输卵管及子宫角中的表达规律及其潜在调控作用,以期为研究胚胎发育及附植的分子机制奠定基础。【方法】以合川白山羊为研究对象,采集妊娠19d（P19）山羊子宫角及输卵管组织,以空配19d（C19）为对照,利用H.E染色观察C19组和P19组山羊子宫角组织形态,利用qRT-PCR技术检测了胚胎附植相关基因（WNT5a、OPN、VEGFA）、TETs（TET1、TET2、TET3）、细胞程序性死亡相关基因（凋亡相关基因（BAX、BCL2、Caspase9）、焦亡相关基因（GSDMD、NLRP3、Caspase1）和炎症相关基因（NF-kB、TNF-α））的相对表达,并分析了TETs及细胞程序性死亡相关基因在输卵管和子宫角组织的表达相关性。【结果】H.E染色结果显示,在P19组中山羊子宫角的腺体增多,形态多变。qRT-PCR结果显示,OPN在P19组山羊子宫角中的表达量极显著高于C19组（P＜0.01）,BAX/BCL2的表达量显著增加（P＜0.05）,而WNT5a和 VEGFA表达差异不显著;TET1、TET2、TET3在山羊子宫角及输卵管中均有表达,在C19组和P19组山羊子宫角中TET1及TET2的表达量极显著高于C19组和P19组中TET3的表达（P＜0.01）;在P19组山羊输卵管中TET2（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase1（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）显著增高。相关性分析表明,输卵管中TET2与TET3（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase9（P＜0.05）显著正相关;子宫角中,TET3与VEGFA（P＜0.05）、WNT5a（P＜0.01）显著负相关,胚胎附植关键基因OPN与Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.05）显著正相关,而细胞焦亡关键基因GSDMD在输卵管与子宫角中均与Bax（P＜0.05）、Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）呈显著正相关。【结论】在妊娠早期山羊子宫角和输卵管中TETs表达与细胞程序性死亡部分基因表达具有一定的相关性,推测TETs与细胞凋亡或焦亡的发生对输卵管、受精卵、早期胚胎及子宫的发育具有一定的调控作用。胚胎附植关键基因OPN与焦亡相关基因显著相关,暗示妊娠早期子宫角中细胞焦亡的发生可能参与胚胎附植。为研究TETs通过细胞程序性死亡相关基因在妊娠早期输卵管及子宫角中的表达规律提供了理论参考。     

光照强度对樱桃谷肉鸭c-fos、生物钟基因表达 及褪黑激素的影响

【目的】研究持续黑暗下给予樱桃谷肉鸭不同强度的瞬时光照,对下丘脑、间脑、垂体和中脑中c-fos基因及相关生物钟基因的表达及血浆和肝脏中褪黑激素含量的影响。【方法】选用144只健康且体重接近的1日龄樱桃谷肉鸭饲养至21日龄,22日龄时随机分为2组,每组6个重复,持续黑暗7 d,期间自由采食和饮水,分别采用10 Lx和80 Lx的LED白光刺激1.5 h,暗适应1.5 h后立即从每个重复选取1只接近平均体重的肉鸭,检测下丘脑、间脑、垂体和中脑c-fos和生物钟基因的表达量,检测血浆和肝脏褪黑激素含量。【结果】10 Lx组的下丘脑和中脑c-fos表达量显著高于80 Lx光照组（P＜0.05）,间脑中c-fos的表达量显著低于80 Lx光照组（P＜0.05）,两组垂体组织中c-fos表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx组相比,10 Lx组下丘脑生物钟基因Bmal1、Bmal2、Clock和Per2表达量均显著提高（P＜0.05）,Cry1表达量也有提高的趋势。10 Lx组间脑Bmal1的表达量显著提高（P＜0.05）,Bmal2、Clock、Per2和Cry1的表达量无显著差异（P＞0.05）。10 Lx组中脑Clock和Per2的表达量显著高于80 Lx组（P＜0.05）,两组Bmal1、Bmal2和Cry1表达无显著影响（P＞0.05）。不同强度的瞬时光照对垂体中生物钟基因的表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx组相比,10 Lx组肉鸭血浆中褪黑激素含量显著降低（P＜0.05）,肝脏中褪黑激素含量显著升高（P＜0.05）。【结论】持续黑暗下,短暂高光强刺激可抑制下丘脑和中脑c-fos的表达,而提高间脑c-fos基因的表达,同时减弱了肉鸭下丘脑和间脑生物钟基因表达的振幅。     

新疆褐牛与安格斯牛胴体及肉质性状及脂代谢相关基因表达差异比较

【目的】探明新疆褐牛与国外优良品种安格斯牛产肉性能及肉品质差异、体脂代谢相关基因及其产物表达的品种间的差异性。【方法】选择相同饲养管理条件下24月龄新疆褐牛和安格斯牛进行屠宰试验,测定其胴体性状和肉品质性状;采集背最长肌和皮下脂肪,采用石蜡切片技术观测脂肪组织和肌肉组织形态学差异;利用实时荧光定量PCR检测脂肪酸合成酶（fatty acid synthesase,FAS）、脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein 4,FABP4）、激素敏感酯酶（hormone-sensitive lipase,HSL）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）和瘦素（Leptin,LEP）基因mRNA表达量;采用蛋白免疫印迹（Western blot）测定FAS、HSL、LPL蛋白表达水平。【结果】1）新疆褐牛净肉率极显著高于安格斯牛（P＜0.01）,而背膘厚度显著低于安格斯牛（P＜0.05）。其余所测定的胴体性状相关指标均无品种间差异（P＞0.05）。2）新疆褐牛肉色L*显著低于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛平均肌纤维直径和横截面积均显著大于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛皮下脂肪组织单位面积脂肪细胞个数极显著多于安格斯（P＜0.01）,其余所测定的肉品质性状相关指标均无品种间差异（P＞0.05）。3）新疆褐牛与安格斯牛背最长肌和皮下脂肪FAS、FABP4、HSL、LPL、LEP等5个基因mRNA表达量均差异不显著（P＞0.05）;新疆褐牛背最长肌组织中FAS蛋白表达量极显著低于安格斯牛（P＜0.01）;HSL蛋白表达量显著低于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛皮下脂肪组织中HSL蛋白表达量显著低于安格斯牛（P＜0.05）。【结论】研究发现新疆褐牛产肉性能较好;但安格斯牛肉色较亮,且嫩度较好,体肪沉积能力较强。两品种间脂代谢相关基因产物FAS和HSL蛋白差异可能与安格斯肉牛背膘厚度差异有关。     

藏猪和大约克猪FABP3基因多态性及差异表达分析

【目的】脂肪酸结合蛋白3(FABP3)参与长链脂肪酸的摄取及利用，在脂肪沉积中发挥重要作用。探究FABP3基因在藏猪和大约克猪间的基因多态性和表达差异可为藏猪品质改良提供分子机制参考。【方法】选取180日龄藏猪和大约克猪为研究对象，对两猪种FABP3基因5’侧翼区和CDS区进行单核苷酸多态性（SNPs）筛选，使用实时荧光定量检测FABP3基因在肝脏、背最长肌和背脂3个组织中的表达量。【结果】在FABP3基因5’侧翼区筛选到T-114C和C-635A等2个SNPs位点，且SNPs位点基因型频率在藏猪与大约克猪群体间均呈极显著差异（P <0.01）；经转录因子预测发现这2个SNPs位点与前脂肪细胞的更新、分化以及脂肪沉积相关，推测这两个多态性位点是参与调控FABP3基因表达的重要功能位点。FABP3基因在藏猪肝脏、背最长肌中的表达量极显著高于大约克猪（P<0.01），在背脂中的表达量显著高于大约克猪（P <0.05）。【结论】推测FABP3基因可能为调控藏猪脂肪代谢的重要候选基因，在藏猪脂肪沉积中呈正向调控作用。     

广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性研究

为探讨广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性,以其耳组织为试验材料,经PCR扩增获得广西巴马小型猪SLA-DQB外显子2片段,片段大小为273 bp,含有1个RsaI酶切位点和5个HaeIII酶切位点,基因型分别为27bp/246 bp和84 bp/83 bp/7 bp/16 bp/29 bp/54 bp。采用PCR-RFLP对30头广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的PCR扩增产物进行多态性分析,发现广西巴马小型猪封闭群内S,LA-DQB基因外显子2无多态性位点;而克隆测序及同源性比较分析表明,广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2序列与普通猪（Sus Scrofa）、人类（Homo sapiens）的同源性分别为94.1%、79.1%。     

藏猪生长激素（pGH）基因多态性研究

猪生长激素（pGH）是猪生长发育性状重要的候选基因之一。采用PCR RFLP技术检测藏猪pGH基因+159～+734 bp片段的Dra I、Apa I和Msp I酶切多态性。结果显示,藏猪群体中Dra I酶切全部切开,无多态;Apa I酶切具有4个等位基因,出现5种基因型,其中CC基因型（299A/432C）频率最高,为0.7857;藏猪群体Msp I酶切出现3种基因型,杂合性CT基因型频率最高,为0.5089,等位基因C和T频率分别为0.5580和0.4420。经比较,藏猪pGH基因Dra I酶切位点与其他猪种一样无多态性,而Apa I酶切出现了特异的432突变位点,Msp I酶切等位基因分布相对均衡,表现出与其他猪种的差异。     

LncFAM200B对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验,分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响,为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织,采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞;构建包装lncFAM200B超表达腺病毒,设计合成其siRNA干扰序列;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平;采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞;lncFAM200B超表达后,脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05）,随着诱导分化时间的增加,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势,PTEN表达量呈现先增高后降低趋势;细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05）,且胞内形成较大脂滴;超表达4 d后,细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.05）。干扰lncFAM200B可显著降低脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2的表达水平（P<0.05）,降低细胞脂肪沉积,且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P<0.05）;干扰lncFAM200B后其潜在靶基因SIRT1呈现先升高后降低的表达趋势,PTEN则相反。CCK-8增殖实验表明,lncFAM200B超表达72 h后,细胞增殖效率显著降低（P<0.05）,而干扰lncFAM200B后72 h后细胞增殖效率显著增强（P<0.05）。【结论】lncFAM200B可能通过影响脂肪分化标志基因C/EBPα和AP2,脂肪合成相关基因SIRT1和PTEN的表达从而影响牦牛肌内脂肪沉积,但其具体机制还需要进一步研究。     

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

藏猪促红细胞生成素(EPO)基因多态性分析

选取高海拔低氧环境饲养的藏猪、长白猪为研究对象,利用直接测序法和PCR-RFLP分子标记技术对促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)基因进行多态性分析,结果表明,藏猪EPO基因相对于长白猪存在16个转换,1个15bp片段的缺失。     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

甘加藏羊发情周期和乏情期HPO轴中THRβ mRNA和蛋白的表达分布

甲状腺激素(TH)通过与其靶细胞受体特异性结合发挥其生物学效能。为阐明松果体、下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamic-pituitary-ovary axis, HPOA)甲状腺激素受体β(Thyroid hormone receptor β, THRβ)基因和蛋白的表达及分布对季节性繁殖动物甘加藏羊(Ovis aries)生殖活动的调节。本研究以处于发情周期和乏情期的甘加藏羊为研究对象,应用RT-qPCR、Western blot 和免疫组织化学方法检测和分析了松果体、HPO轴中THRβ mRNA及其蛋白的表达和分布。结果显示,THRβ mRNA及其蛋白在松果体和HPO轴组织中均有表达和分布。在松果体中,THRβ mRNA及其蛋白的表达量均在乏情期最高,显著(P<0.05)高于发情周期;在下丘脑中,THRβ mRNA表达量在发情后期显著(P<0.05)高于其他时期,蛋白表达量在间情期显著(P<0.05)高于其他时期;在垂体中,THRβ mRNA及其蛋白的表达量在间情期显著(P<0.05)高于其他时期;在卵巢中,THRβ mRNA及其蛋白的表达量在发情后期显著(P<0.05)高于其他时期。免疫组织化学结果显示:THRβ免疫阳性产物主要分布在松果体细胞的细胞浆,下丘脑的神经胶质细胞、大神经元胞体和椎体细胞胞浆,腺垂体的嗜酸性和嗜碱性细胞胞浆,卵巢的颗粒细胞胞浆、卵泡内膜细胞及黄体细胞。甘加藏羊发情周期和乏情期松果体、HPOA组织中THRβ mRNA和蛋白的差异性表达,表明THRβ参与调控甘加藏羊的生殖活动。     

二花脸猪linc-NORFA核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】 前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】 采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】 通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988 — -684 bp（转录起始位点作为+1）,生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性（P<0.01）,同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达（P<0.01）。【结论】 鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。     

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法,为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×10¹-1.56×10⁸拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为：y =-3.295 lg(x) + 45.995,线性相关系数R²为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×10⁴拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P = 0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。     

藏绵羊BOLL的分子特征及其在睾丸中的表达调控与功能分析

【目的】BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用。研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解。【方法】选取3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟）和3岁龄（成年）3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊。以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列（coding sequence,CDS）区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,qRT-PCR）, Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证。【结果】藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域（靠近N端）和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序。绵羊BOLL在不同哺乳物种间（特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛）具有高度的序列同源性和进化保守性。BOLL蛋白与10个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用。随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调。BOLL蛋白主要存在于性成熟后（1岁龄和3岁龄）睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布。qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs（microRNAs,miRNAs）oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调（P<0.01）,而长链非编码RNAs（long noncoding RNAs,lncRNAs）LOC105602204、LOC105603195 和LOC105616228以及环状RNAs（circular RNAs,circRNAs）circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调（P<0.01）。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL 3′UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性。【结论】报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用。BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化。     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究（摘要）

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及引物步移法（primer-walking）的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,具体步骤：通过已经发表的部分猪脂联素基因cDNA序列设计特异引物用于BAC克隆的筛选。以超级池DNA为模板进行第1次PCR反应,筛出含阳性克隆的超级池;以挑出的阳性超级池的3维池DNA为模板进行第2次PCR反应,根据阳性板池、列池、行池序号得到可能的阳性克隆号;依照阳性克隆号从工作文库中取出相应的BAC克隆,平板划线37℃倒置培养20 h。待菌落长好后,做菌体PCR鉴定,以确认克隆的正确性。将获得的BAC阳性克隆平板划线,37℃摇菌过夜培养,进行BAC的提取、纯化与酶切回收。先以M13引物向BAC两端测序,再以发表的cDNA序列外显子1设计测序引物采用primer-walking的方法,获得连续的DNA序列。采用PCR-RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行分析。[结果]脂联素基因的5′侧翼区-1 010 bp（G/A）的SNP位点,本地猪种中GG基因型频率明显高于外来猪种;-394 bp（T/C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种中却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1 010 bp（G/A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394 bp（T/C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关。     

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。     

基于重组截短蛋白mp-tGAPDH的微小支原体抗体间接ELISA检测方法建立和应用

猪源嗜血支原体(Hemotropic mycoplasma,HM)寄生于猪红细胞表面及骨髓中,引起猪传染性贫血,给我国养猪产业造成危害。近年来病原流行病学调查发现我国流行三种HM,猪支原体(Mycoplasma suis,M. suis 猪附红细胞体),微小支原体(M. parvum)和新种Candidate Mycoplasma hemosuis(CMh)。且M. parvum在是我国浙江和海南猪群中的主要流行嗜血支原体,目前仅M. suis有血清抗体检测方法报道。本研究根据M. parvum ZJ9330株的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计引物扩增404 bp的部分基因片段、原核表达纯化15 ku截短蛋白mp-tGAPDH,Western-blot表明纯化蛋白mp-tGAPDH与小鼠抗mp-tGAPDH血清有较好的反应性。以mp-tGAPDH为包被抗原,建立了检测M. parvum抗体的间接ELISA方法。特异性实验表明,建立的ELISA方法不与猪圆环病毒病、猪瘟、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和弓形虫阳性血清交叉反应。重复性实验表明,该ELISA方法批间和批内重复性低于18.4%,表明该法有较好的重复性。用建立的ELISA方法对浙江省上虞地区5个猪场248份临床送检血清进行了检测, M. parvum血清抗体阳性率为36.69% (91/248)。本研究建立的间接ELISA方法为猪微小支原体的检测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。