猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

利用针对猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CsFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.     

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。     

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。     

猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P0.01或P0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。     

猪圆环病毒3型7个ORFs不能诱导PK-15细胞凋亡

【目的】为了探明猪圆环病毒3型的致病机制。【方法】用PCR技术扩增PCV3的ORF1-ORF7基因片段并克隆到pEGFP-C1载体,构建7个真核表达质粒后分别转染PK-15细胞,在转染后不同时间观察细胞中荧光表达情况,并检测Caspase-3活性变化。【结果】7个真核表达质粒转染PK-15细胞后均可观察到荧光,表明PCV3的ORF1-ORF7基因均可在PK-15细胞中获得表达,但在表达丰度方面存在差异。与单独的PK-15细胞和pEGFP-C1载体转染的PK-15细胞相比,7个真核表达质粒转染PK-15细胞后都未出现Caspase-3活性的显著(P0.05)变化,表明均未引起PK-15细胞发生凋亡。【结论】PCV3的ORF1-ORF7基因均无诱导PK-15细胞发生凋亡的作用。     

猪蓝耳病及继发感染试验诊断与综合防制研究

【研究目的】为了研究猪圆环病毒的分子生物学特征及其发病机理和致病机制,【研究方法】将疑似猪圆环病毒2型的猪脾脏、淋巴结用胰蛋白酶消化处理后接种PK-15细胞,盲传6代后,病毒已经适应PK-15细胞,【研究结果】然后设计一对特异性引物利用PCR技术扩增出ORF2片段中540bp的基因。第6代细胞病毒液经间接免疫荧光检测表明,在荧光显微镜下可见PCV特征的荧光斑,表明毒株具有感染性。【结论】将病毒纯化后进行电镜观察,病毒粒子直径约17nm,圆形,无囊膜,研究结果表明分离的病毒为猪圆环病毒。     

慢病毒介导shRNA抑制Sirt1基因表达对猪前体脂肪细胞凋亡的影响

【目的】探讨慢病毒介导的shRNA干扰系统抑制脱乙酰基酶1(Sirtuin type 1,Sirt1)表达对猪前体脂肪细胞凋亡的影响。【方法】构建pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体,将其感染猪前体脂肪细胞,运用Hoechst33258染色,于荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测细胞凋亡标志物Cleaved caspase-3的表达情况。【结果】pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体可抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显微镜下可见细胞体积缩小、染色质凝集、核固缩等典型的凋亡特征;流式细胞术显示细胞凋亡率较空载体对照组明显增加,早期和晚期凋亡细胞百分率分别从4%和9%(P0.05)上升至30%和32%(P0.05);Western印迹检测显示Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调。【结论】慢病毒介导的shRNA可有效地抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显著促进细胞凋亡,提示Sirt1可能在前体脂肪细胞凋亡中发挥着重要作用。     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。     

猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救

【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建,PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应,且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合,因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备

【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒（CSFV）感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白,经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α,分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白,通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白,且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白,主要在细胞质中表达,且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应,即具有较好的反应特异性,其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达,且TNF-α与其下游因子（TRAF1）的表达变化趋势基本一致,即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点,可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生,参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能,CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致,说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路,使机体产生炎症反应。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一,其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍,增加了患高胆固醇血症的风险,从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近,成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏,且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪,以模拟动脉血管的病理学变化,加速发病进程,为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体,用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法,分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时,通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现,至第7天形成较大的单克隆点,且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段,说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞,通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示,D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中,且有串联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明,人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录,且在其它内脏器官,如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达,而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中,且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现,与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外,对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化,该结果说明,LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低,并且克隆猪肝脏发生了明显病变。     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学研究

【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染,以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点,从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物,对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品,35例PRRSV阳性,阳性率高达74.47%（35/47）;35株均为美洲型毒株,其中有10株属于高致病性PRRSV,占总检测样品的21.28%（10/47）,占阳性样品的28.57%（10/35）;综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染,且存在高致病性毒株。     

棉花NBS-LRR类基因RNA干扰载体的构建及烟草转化

【目的】初步获知棉花NBS-LRR类基因的生物学意义,构建干扰载体。【方法】以抗枯萎病棉花中棉12号为材料,用霍格兰营养液培养至三叶期,进行枯萎病菌接菌诱导处理,以不接菌为对照。利用cDNA-AFLP技术筛选差异基因片段,在GenBank中进行序列同源性比对,找到抗枯萎病基因片段,该基因片段的序列与GenBank中报道的序列同源性达到72%。将此基因片段以正向和反向插入到pPZP35S,经限制性酶切和质粒PCR鉴定。【结果】已成功构建了干扰载体。采用农杆菌侵染法将干扰载体转入烟草中。【结论】为研究棉花NBS-LRR类基因的功能打下基础,为通过转基因技术深入研究该基因在棉花抗病机理创造条件。