猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种可以定量检测猪圆环病毒3型(PCV3)的荧光定量PCR检测方法。【方法】设计与验证1对PCV3特异性引物,以系列稀释后的PCV3全基因组质粒为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增。【结果】该方法不能检出PCV1与PCV2等常见猪DNA病毒,精确灵敏度至少达到100 copies,所绘制标准曲线回归方程的决定系数为0.999,扩增效率为83.6%,对53份临床样品的检测阳性率高于常规PCR。【结论】建立1种具有良好特异性、敏感性与重复性的定量检测PCV3的荧光定量PCR方法。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。     

广西猪群新发感染猪捷申病的检测诊断

【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立PTV的RT-PCR检测方法,并对广西部分猪场腹泻病例进行猪捷申病的感染诊断。【结果】所建立的方法能特异性地扩增PTV,不能扩增猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒、猪丁型冠状病毒。建立的方法具有较高的敏感性,可检测低至1.16 pg/μl的质粒模板及12.15 pg/μl的核酸模板。应用建立的RT-PCR方法对2018年3月-2019年4月从广西部分猪场采集的235份病猪腹泻粪便进行PTV临床检测,PTV阳性为24份,阳性率为10.21%。【结论】建立的PTV RT-PCR方法简单特异、灵敏度高,可适用于实验室PTV检测诊断。广西部分受检猪场已存在PTV感染,应予以警惕,加强监测与防控。     

猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）TaqMan实时荧光定量（RT-qPCR）检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品（粪便样品39份,肠道样品44份）进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×10¹拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份（22份粪便样品,9份肠道样品）检出率为37.3%（31/83）,显著高于普通PCR检测结果（检出率12.0%（10/83））。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332 bp（经典株）和241 bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100 fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。     

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础.[方法]采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPT)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析.[结果]从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽Ⅰ型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60 h,ICPI为1.45;分离株F基因112~117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%.[结论]猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势.     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾

【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。     

广西北部蔗区甘蔗黄叶病调查

【目的】探明甘蔗黄叶病在广西北部蔗区的发生情况,为甘蔗健康种苗生产提供科学依据。【方法】从广西北部蔗区采集不同品种显症或不显症甘蔗样品, 采用引物（P1：5′-AATCAGTGCACACATCCGAG-3′/ P2：5′-GGAGCGTCGC
CTACCTATT-3′）进行SCYLV一步法RT-PCR检测。【结果】柳州郊区蔗区调查的8个品种中有6个品种带毒,带毒率为75.0%;柳城蔗区调查的7个品种全部带毒,带毒率为100.0%;鹿寨蔗区调查的4个品种中有2个品种带毒,带毒率为50.0%;宜州蔗区调查的6个品种中有4个带毒,带毒率为66.7%。在所调查的品种中,柳城03-182、桂糖21和台糖16在作为调查对象的蔗区均检测出黄叶病毒;主栽品种ROC22也在柳城和宜州蔗区检测出黄叶病毒。【结论】甘蔗黄叶病已在广西北部蔗区发生,且有向外蔓延的趋势。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

猪促炎细胞因子多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL-6/β-actin、TNF-α/β-actin的多重TaqMan real-time PCR检测方法。标准曲线的相关系数均达到0.998以上;初始模板的检出下限均达到10拷贝/μL;只有以目标cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才能检测到荧光信号;组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染仔猪心肌中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平进行检测。结果表明,所建立的多重TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因的检测及定量分析。     

SYBR GreenI模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力

 【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。