猪IL-1β与IL-18SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

IL-1β和IL-18是重要的促炎症细胞因子,在介导机体炎症反应中起重要作用.为了建立在体外定量检测猪细胞因子IL-1β和IL-18mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,依据GenBank中登录的猪细胞因子基因IL-1β、IL-18及管家基因β-actin核苷酸序列,设计特异性引物,经RT-PC...     

脂多糖对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α的影响

研究了脂多糖的浓度、刺激时间对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响。分别用不同浓度的脂多糖和不同的刺激时间处理猪肺泡巨噬细胞,收集细胞,提取RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-1β、TNF-αmRNA表达水平;同时收集培养上清,用ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。结果表明,脂多糖浓度(1~1000ng/mL)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05);刺激时间(1~24h)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05),且蛋白的表达水平迟于mRNA的表达水平。脂多糖诱导猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α具有剂量、时间依赖性。     

苦参碱对奶牛子宫内膜上皮细胞抗炎作用及其机制

为探究苦参碱在抗炎方面的作用,本试验用LPS建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型,通过MTT法测得LPS最佳刺激浓度为30μg/mL,作用12h;苦参碱的低中高浓度分别为5、10、20μg/mL。RT-PCR分别检测3、6、12h各组细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA的表达变化,结果表明,苦参碱显著(P0.05)降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达,具有较强的抗炎作用。     

体外棕榈酸诱导自噬调节奶牛淋巴细胞炎症通路

为探讨体外棕榈酸(Palmitic acid,PA)是否可以通过自噬调节奶牛淋巴细胞炎症信号通路的激活,分离健康奶牛淋巴细胞,采用3-MA(3-Methyladenin,细胞自噬抑制剂)和不同质量浓度PA作用于淋巴细胞,收集细胞及上清,利用qRT-PCR检测淋巴细胞LC3B、Beclin1、mTOR、UKL1、SQSTM1、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达情况;利用CCK-8和酶联免疫吸附法分别测定细胞活性和促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量。CCK-8结果表明:PA显著抑制淋巴细胞活性(P0.01),添加自噬抑制剂3-MA后细胞活性显著增强(P0.01);qRT-PCR结果表明:与对照组(PA=0μg/mL)相比,PA处理组(不含3-MA)ULK1和LC3B mRNA表达极显著增加(P0.01),mTOR、Beclin1和SQSTM1 mRNA表达极显著降低(P0.01);IL-1β和IL-6 mRNA表达显著增强(P0.01),而TNF-α未表达;添加3-MA后,与1μg/mL PA处理组相比较,SQSTM1和Beclin1极显著增加,而LC3B mRNA表达极显著降低(P0.01);IL-1β和IL-6 mRNA表达显著下调(P0.01);PA增加促炎因子IL-6和IL-1β的释放(P0.01),显著抑制TNF-α释放(P0.01),而含有3-MA的PA混合处理组则显著降低(P0.01)。综上,PA可通过自噬调节奶牛淋巴细胞炎症信号通路的激活。     

刺五加苷B对仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白及细胞因子mRNA表达量的影响

以仔猪小肠上皮细胞为模型,应用实时荧光定量PCR方法测定相关基因指标,研究刺五加苷B(EB)对仔猪小肠上皮(IPEC-J2)细胞紧密连接蛋白及炎性细胞因子mRNA表达量的影响。结果表明:0.1 mg/m L刺五加苷B显著增强肠道细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-3、ZO-1和抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的mRNA表达量,且减弱促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ的mRNA表达量。说明刺五加苷B可通过改变细胞间紧密连接蛋白和细胞因子的表达从而对维持肠道屏障功能的完整性起到促进作用,有益于仔猪肠道的健康发育。     

阿魏酸抗LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性作用

[目的]为了探明阿魏酸的抗炎机制.[方法]采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞.用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力.采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测.[结果]阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响.药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达.[结论]阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用.     

发酵乳杆菌对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤干预作用的研究

旨在研究发酵乳杆菌能否通过抑制NF-kB信号通路的激活,调控下游炎性细胞因子,进而对脂磷壁酸(LTA)所诱导的牛子宫内膜细胞(BEND)炎性损伤发挥保护作用,并通过体外试验对其作用机制进一步研究,为解决牛子宫内膜炎的治疗难题提供方向。以牛子宫内膜细胞为研究对象,LTA和发酵乳杆菌分别作为毒药与解药来建立体外细胞试验模型,测定细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌量和炎性相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65 mRNA的表达量。结果表明:LTA组、LTA+Lf组、Lf组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达水平均高于对照组。LTA组与对照组比较差异极显著(p0.01);Lf组与对照组比较,TNF-α、IL-6细胞因子差异不显著(p0.05),IL-1β、IL-8细胞因子差异显著(p0.05);LTA+Lf组与LTA组比较,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达量显著降低(p0.05)。LTA组、LTA+Lf组、Lf组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量均高于对照组。LTA组与对照组相比,7种基因m RNA的表达量极显著增加(p0.01);Lf组与对照组相比,TNF-α、IL-6基因mRNA的表达量增加不显著(p0.05),IL-8基因mRNA的表达量增加显著(p0.05),IL-1β、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量极显著增加(p0.01);LTA+Lf组与LTA组相比,7种基因mRNA的表达量均极显著降低(p0.01)。发酵乳杆菌能够抑制NF-kB信号传导通路,调控炎性细胞因子的表达与释放,抑制炎性反应的发生,缓解LTA的细胞毒性,对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤起干预作用。     

猪圆环病毒2型体外刺激猪髋动脉血管内皮细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

通过PCV2病毒感染猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化,探讨PCV2感染诱导炎症产生的免疫机制。将PCV2病毒体外接种PIEC,感染不同时间后,收集样品,荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA转录水平的变化。结果显示,PCV2感染PIEC后,对促炎症细胞因子IL-1β、IL-18及趋化因子IL-8主要起上调表达作用。由此推测细胞因子在体内的综合效应会导致PCV2感染早期机体产生过度炎症反应,并趋化中性粒细胞,引发机体免疫抑制,影响机体特异性免疫应答的正常运转,为PCVD的发病创造条件。     

獐茅AlHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因，根据已克隆的AlHAK1即β-actin碱基序列，分别设计了实时定量特异性引物，优化了反应的退火温度与引物浓度，并以优化的条件建立了相对定量标准曲线，同时对该方法的稳定性进行了评价。结果表明AlHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1．09和1．04，线性相关系数分别为0．996和0．997，批内及批间变异系数〈5％。所建立的AlHAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好，为进一步探索AlHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AlHAK1农作物的检测奠定了方法学基础。     

獐茅AIHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因,根据已克隆的AIHAK1及β-actin碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价.结果表明AIHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数<5%.所建立的A1HAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AIHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AIHAK1农作物的检测奠定了方法学基础.     

PRRSV诱导猪体内肺泡巨噬细胞炎症模型的建立

[目的]建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)诱导体内猪肺泡巨噬细胞(PAM)炎症模型,评价PRRSV感染对仔猪免疫系统的影响,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断及科学防控提供参考依据.[方法]以PRRSV-GXNN1396株人工感染30日龄健康断奶仔猪,复制出PRRS病症,剖杀后采集病料,通过组织病理学和RT-PCR检测观察各免疫器官组织的病理变化及其病毒分布情况,并检测PAM细胞内的COX-1、COX-2等酶活性变化及IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、MCP-1和TNF-α等炎性细胞因子水平变化.[结果]断奶仔猪接种PRRSV-GXNN1396株后第3d开始表现出典型的PRRS病症,PRRSV主要集中在肺脏、颌下淋巴结、血液和扁桃体等样品组织中,攻毒仔猪各主要器官的实质细胞及有关淋巴细胞均出现不同程度坏死和炎症细胞浸入现象,尤其以肺脏、肾脏、脾脏等器官受损严重,出现巨噬细胞和淋巴细胞浸润.PRRSV感染早期(第3d)仔猪PAM细胞中的ROS水平及COX-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等因子水平均呈升高趋势,且COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α因子水平极显著升高(P<0.01);随着感染天数的增加,PAM细胞内的COX-2、IL-6和IL-8因子水平呈下降趋势,TNF-α因子水平呈上升趋势.[结论]成功建立了PRRSV诱导仔猪体内PAM细胞炎症模型,进一步佐证PRRSV主要侵害猪的免疫器官组织,以达到免疫抑制的效果,并推断感染第3d是病猪炎症反应的高峰期.     

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

Lactic Acid Reduces LPS-Induced TNF-α and IL-6 mRNA Levels Through Decreasing IKBα Phosphorylation

This study explored the effects over time of lactic acid (LA) on I _κBα phosphorylation and nuclear factor-kappa B (NF-κB) p65 protein expression, and on tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) mRNA levels in rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMMVECs) stimulated by lipopolysaccharide (LPS). IκBα, phosphorylated IκBα (ρ-I _κBα) and p65 protein levels were monitored by Western blot analysis, and TNF-α and IL-6 mRNA levels were analyzed using real-time PCR. LA treatment reduced TNF-α and IL-6 mRNA levels in LPS-stimulated RIMMVECs, with the greatest effect being after 3 h. The highest inhibitory effect of LA on I _κBα phosphorylation to prevent activation of NF- _κB was after 6 h. These results suggest that LA reduces TNF-α and IL-6 mRNA levels through decreasing IκBα phosphorylation and blocking the dissociation of IKK complex, which prevents activation of NF- _κB.     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

油菜花粉多糖对荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α产生及其mRNA表达的影响

 【目的】研究油菜花粉多糖（LBPP）对荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α的诱生及其mRNA表达的影响。【方法】通过动物抑制性肿瘤法制备肿瘤模型,采用双抗体夹心ELISA法检测IL-2、TNF-α含量,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-2、TNF-α mRNA的表达。【结果】LBPP有明显抗肿瘤作用,200 mg•kg-1高剂量组抑瘤率可达51.26%,明显优于环磷酰胺46.22%;LBPP可显著促进荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α分泌（P＜0.01）,提高荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α mRNA的表达（P＜0.01）,高剂量组提高率分别达56.37%、105.24%、1364%和1289%。【结论】LBPP通过提高机体IL-2、TNF-α mRNA的表达而发挥抗肿瘤作用。     

重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素免疫山羊皱胃细胞因子表达定位

【目的】检测重组雌、雄捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(rHco-GAL-f/m)免疫山羊皱胃转录细胞因子。【方法】用rHco-GAL-f/m免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫不攻虫组(D)山羊皱胃中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA转录进行定位,并对上述细胞因子阳性反应细胞数量进行分析。【结果】A组山羊皱胃组织中没有检测到细胞因子,其它3组仅在皱胃黏膜下层中检测到了上述细胞因子。B、C和D组间IL-4和IL-6阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中C组明显高于其它两组;B、C和D组间IL-1?、IL-2和TNF-α阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中D组明显高于其它两组;IFN-γ阳性反应细胞数在B组和C组之间差异不显著(P0.05),D组与B组和C组之间差异显著(P0.05),且明显高于其它两组。【结论】重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素能够诱导山羊皱胃局部免疫应答。     

苏钟猪TLR4多态性及编码区C1027A功能分析

【目的】研究苏钟猪TLR4的多态性及其编码区第1 027 bp处突变对TLR4蛋白功能的影响。【方法】采用PCR-SSCP的方法检测TLR4在苏钟猪中的多态性并利用real-time PCR方法检测不同基因型（CC型和AC型）的猪肺泡巨噬细胞经脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导后,TLR4及促炎症因子TNF-α、IL-1β表达量的变化情况,探讨该处突变对TLR4识别LPS的影响。【结果】①共检测到3个突变：G962A、C1027A、G960A,其中前两个为有义突变,且C1027A突变可引起编码氨基酸性质的改变;②LPS能快速诱导猪肺泡巨噬细胞中TLR4及促炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平上调且TLR4编码区C1027A不同基因型（CC型和AC型）的猪肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophages,PAMs）对LPS的敏感性及反应强度存在显著性差异。【结论】苏钟猪TLR4编码区的序列相对保守、多态含量较低,群体遗传变异程度较小。TLR4编码区C1027A突变能影响TLR4识别LPS的能力,等位基因C为苏钟猪抗革兰阴性菌感染的优势基因。