4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性.     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列的遗传变异分析

[目的]了解H9N2亚型禽流感病毒分离毒株A／Chicken／Hebei／WD／98（简称WD98）与其他参考毒株的遗传变异关系。[方法]采用RT—PCR技术扩增了WD98分离株8个基因片段的全基因序列,并将其与7个参考毒株进行同源性比较及遗传进化分析。[结果]分离株WD98与7个参考毒株全基因组同源性为91．1％～95．8％,与A／duck／HongKong／Y280／97的全基因组核苷酸同源性最高（95．8％）,而与A／chicken／Pakistan／2／99同源性最低（91．1％）。WD98株的HA基因裂解位点为R—S-S—R↓G,其第226位受体结合住点为Q。[结论]禽流感病毒WD98毒株为低致病性禽流感病毒,不易感染人,与A／duck／HongKong／Y280／97亲缘关系最近,同属于欧亚种系A／Chicken／Beijing／1／94亚系。而在这同一亚系中,WD98株与A／Chicken／Beijing／1／94株的亲缘关系最远。     

AIV F株HA和NA全基因的扩增及序列比较

根据禽流感病毒（AIV）各基因片段两端保守区序列设计锚引物,应用cDNA末端快速扩增法获得了AIV分离株A/Chichen/Shanghai/F/98(N9N2)的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）全长基因。15个毒株的HA和NA序列比较结果表明：F株与Chicken/Beijing/1/94、Duck/HongKong/Y280/97同源率较高,为94.4%～97.4%,但与香港人流感病毒HongKong/1073/99、HongKong/1074/99及Quail/HongKong/G1/97同源率较低,为90.3%～91.9%。F株与Duck/HongKong/Y280/97的NA基因不但同源率高达97.4%,而且均在205位核苷酸之后缺失9个核苷酸。另外,30个毒株的HA基因cDNA比较结果显示,最后46个氨基酸的编码序列高度保守。     

一株H9N2型禽流感病毒全基因的序列分析

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒A/chicken/Zhuhai/154/03(H9N2)的8个基因片段(HA,NA,M,NP,NS,PA,PB1,PB2)。然后将其克隆到线状克隆载体pGEM-Teasy vector后进行序列测定和拼接,并将克隆到的8个基因片段与其他禽流感病毒毒株(A/Chicken/Guangdong/SS/94,A/Swine/Hong Kong/9/98-MA,A/Chicken/Shanghai/F/98,A/Duck/Hong Kong/Y439/97,A/Quail/Hong Kong/G1/97,A/Chicken/Shanghai/4/01)各个基因的相应序列进行比较分析。结果表明:克隆到的A/chicken/Zhuhai/154/03(AZH154)株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:AZH154的各基因与A/Chicken/Guangdong/SS/94株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有67.5%),与A/Chicken/Shanghai/4/01各基因同源性高于A/Swine/HongKong/9/98-MA,A/Duck/Hong Kong/Y439/97和A/Chicken/Shanghai/F/98各基因同源性。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防禽流感(AI)提供了科学依据。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析

[目的]探讨2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

H9N2亚型禽流感病毒PA基因的克隆与序列分析

对甘肃H9N2亚型的A/Chicken/GanSu/2/99(A/CK/GS/2/99)株PA基因进行了克隆、测序及分子进化分析.结果表明:该病毒PA基因开放阅读框由2 151个碱基组成,编码716个氨基酸;其与A/Quail/HongKong/NT28/99(H9N2)株和A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)株的核苷酸同源性分别为98.4%和98.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.7%;与A/HongKong/156/97(H5N1)和A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的核苷酸同源性分别为89.0%和87.8%,氨基酸同源性分别为为93.9%和94.3%.     

野鸡源H9N2亚型禽流感病毒NA基因的序列分析

通过病毒RNA抽提、RT-PCR、克隆，试验一次性获得野鸡源禽流感病毒A／Pheasant／Guangdong／GZI／2003（H9N2）NA全基因．序列分析及联机检索表明，该病毒的NA基因由1458bp组成，其中开放阅读框（ORF）l401bp编码466个氨基酸；ORF与A／Chicken／Guangdong／11／97同源性最高，达98％；与A／Chicken／Guangdong／11／97的NA亲缘性最近．     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT—PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N禽流感病毒毒株（HB2002）中克隆到血凝素基因（HA）序列,该克隆基因全长1714hp,提交GenBank,获得登录号DQ285546。同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A／duck／Hainan／4／2004（H6N2）,A／duck／HongKong／3600／99（H6N2）毒株有99％的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近。由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB2002为低致病性禽流感病毒．     

河南地区一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA基因变异分析

由发病蛋鸡体内分离得到一株禽流感病毒,经PCR、血凝试验和免疫荧光鉴定为H9N2亚型,命名为A/Chicken/henanxy/2010(H9N2),病毒对SPF鸡无致病性,对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点为PSRSSRGLF,符合低致病性禽流感的分类标准;并将HA基因和自GenBank读取的H9N2病毒的HA基因序列比较,表明河南分离株属于欧亚分支中的Y280-like分支,与A/Chicken/shandongHL/2010(H9N2)氨基酸同源性94.8%,可能是Y280-like个别核苷酸突变的一株。     

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

禽流感病毒（AIV）在高免疫压力情况下会发生变异而逃避免疫系统的监视。其NS1蛋白共有230个氨基酸,其中前73个氨基酸残基以二聚体形式存在,包含了所有RNA的结合活性。NS1的氨基端1—73位是mRNA的结合区,氨基端1—100位是双股RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的结合区。PKR抗病毒作用机制如下：病毒侵染宿主细胞时,在宿主干扰素的诱导下,双股RNA与PKR结合,同时真核翻译启动子α亚单位发生磷酸化,导致PKR的激活。激活的PKR能同时抑制宿主细胞和病毒mRNA的翻译,从而最终抑制入侵病毒在细胞中的有效繁殖和扩散。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

一株鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006的全基因组序列测定及遗传演化分析

为了解鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006(DK/SH/Y20/06)的来源、特征及其分子演化规律,进一步丰富水禽流感病毒的基因库,对该病毒8个基因片段分别进行了扩增和序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析,并与GenBank登录的相关病毒进行了遗传演化分析。结果表明,DK/SH/Y20/06的HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于欧亚分支;NA基因与A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)在同一分支内,核苷酸序列同源性为98.3%;而PB2、PB1、NP、PA基因与目前在国内流行的H6亚型禽流感病毒关系密切;M基因与A/environment/Korea/CSM05/2004(H3N1)处于同一分支;而NS基因与A/wild duck/Korea/YS44/2004(H1N2)同源性最高。且DK/SH/Y20/06的8个基因与美洲H4N6亚型AIV分离株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。可见,DK/SH/Y20/06可能是由H4N6、H6N2、H6N5、H3N1和H1N2等不同亚型来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。