一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

湖南洞庭湖区12株H9N2亚型AIV全基因序列的进化分析

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。     

贵州H9N2亚型禽流感病毒NA基因的遗传演化特征

为探明贵州H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,为其科学防控提供参考,通过GenBank登载H9N2亚型AIV参考毒株的神经氨酸酶(NA)基因设计引物,进行RT-PCR扩增,然后克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株的NA基因全长为1 414bp,可编码467个氨基酸,与国内外参考毒株相应序列的核苷酸同源性在87.5%~98.1%;含有6个潜在的糖基化位点;在63~65位缺失T、E和I等3个茎部氨基酸,导致第61位糖基化位点丢失;从NA基因系统发育树看,该毒株属于欧亚种系Y280分支。     

新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PB1基因的克隆与序列分析

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势,本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/Chicken/Xinjiang Baicheng/1/2014(H9 N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析,将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成,编码757个氨基酸,与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支,其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为99.2%和99.4%,新疆油鸡分离株的PB1基因不属于欧亚分支G1、A/CK/BJ/94和Y439的任何谱系。     

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为探明贵州H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,为其科学防控提供参考,通过GenBank登载H9N2亚型AIV参考毒株的神经氨酸酶(NA)基因设计引物,进行RT-PCR扩增,然后克隆测序,并进行生物信息学分析.结果表明:H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株的NA基因全长为1 414 bp,可编码467个氨基酸,与国内外参考毒株相应序列的核苷酸同源性在87.5％～98.1％;含有6个潜在的糖基化位点;在63～65位缺失T、E和Ⅰ等3个茎部氨基酸,导致第61位糖基化位点丢失;从NA基因系统发育树看,该毒株属于欧亚种系Y280分支.     

新疆油鸡禽流感病毒Xj14分离株PA基因的克隆与序列分析

为了从分子水平上掌握新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PA基因的遗传进化情况,采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株Xj14的PA基因进行克隆、测序及分子进化分析,将PA基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Gen Bank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PA基因由2 151个碱基组成,编码716个氨基酸,与AIV A/Duck/Hong Kong/Y439/97的PA基因处于同一分支,其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为89.9%和96.9%,在系统进化上属于欧亚分支中的Y439谱系。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT-PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒毒株(HB 2002)中克隆到血凝素基因(HA)序列,该克隆基因全长1 714 bp,提交GenBank,获得登录号DQ 285546.同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A/duck/Hainan/4/2004(H6N2),A/duck/Hong Kong/3600/99(H6N2)毒株有99%的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近.由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓ G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB 2002为低致病性禽流感病毒.     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

[目的]为进一步研究NS1蛋白在流感病毒跨宿主传播中的作用机制奠定基础。[方法]采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,从广东不同地区的12~20日龄正常番鸭群中分离鉴定出多株H9亚型水禽禽流感病毒株,对其中4株分离于正常番鸭的禽流感病毒毒株A/duck/ZQ/303/2007（H9N2）（简称A3）、A/duck/FJ/301/2007（H9N2）（简称C1）、A/duck/NH/306/2007（H9N2）（简称D6）和A/duck/SS/402/2007（简称E2）和1株来源于病死番鸭的H9N2亚型鸭流感病毒A/duck/ZC/1/2007（H9N2）（简称L1）的NS1基因进行克隆测序,并与GenBank中收录的其他NS1序列进行比较,分析NS1基因的进化关系。[结果]4株分离于不同地区正常番鸭群的流感病毒株NS1基因与GenBank中注册的H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为99%~100%,氨基酸同源性为95%~100%。而分离于病死鸭的流感病毒株与H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为94%~97%,氨基酸同源性为93%~99%。遗传进化结果表明：分离于正常鸭群的4株流感病毒NS1基因独成一分支,而L1株与2003年的鸡源AY66473株亲缘关系最近。DNAstar软件分析表明：与L1、AF523514（鸭源）、AY664743（鸡源）、EF155262.1（鹌鹑）相比,A3、C1、D6、E2 4株正常鸭H9N2 AIV毒株的NS1基因核苷酸序列在21（R→Q）7、07、1（KE→EG）8、6（A→S）1、24（V→M）、225（S→N）位点处发生改变,NS1基因的双股RNA依赖性蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）结合区（1~100位氨基酸）39、70、71和86位氨基酸发生变化,导致NS1蛋白潜在的抗原决定簇及其特定区域位于蛋白表面的可能性发生明显变化。[结论]NS1蛋白PKR结合区氨基酸序列变化与病毒的致病性有一定关系。     

禽流感病毒A/Duck/Shnghai/02/99(H9)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank已公布的禽流感病毒H9亚型血凝素蛋白编码基因,设计了一对引物(H1和H2),RT-PCR扩增禽流感病毒A/Duck/Shanghai/02/99(H9)的HA基因,扩增片段与载体pUCm-T的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,重组质粒pUCm-T-HA经限制性内切酶酶切和PCR鉴定后进行测序。BlastN分析结果显示该分离株血凝素编码基因与已发表的鸭源禽流感病毒A/Duck/Shantou/1605/01(H9N2)和A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)血凝素编码基因的核甘酸序列同源性为98%,从而从分子水平确定了该分离株为H9亚型禽流感病毒。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法的建立

【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。     

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

禽流感病毒（AIV）在高免疫压力情况下会发生变异而逃避免疫系统的监视。其NS1蛋白共有230个氨基酸,其中前73个氨基酸残基以二聚体形式存在,包含了所有RNA的结合活性。NS1的氨基端1—73位是mRNA的结合区,氨基端1—100位是双股RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的结合区。PKR抗病毒作用机制如下：病毒侵染宿主细胞时,在宿主干扰素的诱导下,双股RNA与PKR结合,同时真核翻译启动子α亚单位发生磷酸化,导致PKR的激活。激活的PKR能同时抑制宿主细胞和病毒mRNA的翻译,从而最终抑制入侵病毒在细胞中的有效繁殖和扩散。     

一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析

禽流感病毒（AIV）的表面结构蛋白血凝素（HA）在决定病毒致病力、受体结合特性、宿主范围等方面起着关键作用。本研究初步鉴定为高致病力毒株的AIV鹅体分离株A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）的HA基因进行了克隆并测序。结果表明,这一在无胰酶条件下可在单层鸡胚成纤维细胞培养物上形成蚀斑的毒株在其HA裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸的插入物,从而揭示了其高致病力的分子基础。进一步的序列比较发现这一毒株与1997年香港流感病毒A/Hongkong/156/97（HK/97）的HA基因核苷酸和氨基酸同源率分别高达98.0%和98.2%,且其6个糖基化位点、2个受体结合位点及裂解位点碱性氨基酸插入物的序列均完全一致,提示该毒株与HK/97具有相似的生物学特性。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。