牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用

 【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因（invA）和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的 hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌所设计的3对引物分别能扩增出374、724和215 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,3种目的菌在105 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带(奇异变形杆菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌在104 CFU/mL浓度下仍然可见到条带),比单基因PCR低一个稀释度,并且人工模拟试验和市售食品试验检测结果稳定。【结论】该方法操作简单、快速、特异性强和灵敏度高,能够实现对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的快速诊断检测和监控。     

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

灌溉水源中沙门氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立基于SYBR Green I嵌合染料法的灌溉水源中沙门氏菌实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, q PCR)检测方法。【方法】以沙门氏菌侵袭蛋白A (inv A)基因为靶基因，设计1对特异性q PCR检测引物，在对q PCR反应体系和反应条件进行优化后，通过特异性实验和灵敏度实验对q PCR方法进行验证，并制作灌溉水源中沙门氏菌q PCR定量标准曲线，最后与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染来验证该方法的准确性。【结果】经过优化的q PCR检测方法灵敏度检测结果显示最低检测限量为1×10^-1 pg·μL^-1，特异性检测结果显示具有良好的特异性，干扰菌株对本q PCR检测方法无影响，所制作的q PCR扩增标准曲线在2×10⁰～2×10⁵ cfu·m L^-1有较好的线性关系，相关系数为0.999 6，能对沙门氏菌进行准确的定量分析。该方法在与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染时具有同等准确性。【结论】本研究建立的基于SYBR...     

3种单增李斯特氏菌快速检测方法的比较

【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/mL,操作相对简单。【结论】实时荧光PCR方法适合灵敏度要求高、且具备良好实验条件时使用;CPA恒温扩增法适于对灵敏度要求不高、实验室条件简单的基层实验室使用。     

应用LAMP检测方法检测乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌（英文）

[目的]考察LAMP方法检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的可靠性。[方法]使用恒温环介导技术,以单核细胞增生李斯特氏菌编码的李氏溶血素O的hly A基因为研究对象设计引物,建立单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP快速检测方法。[结果]LAMP法特异性强,灵敏度与荧光定量PCR相当。使用LAMP方法检测各种乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌结果与细菌分离方法检测结果完全一致。[结论]LAMP检测结果可以通过肉眼直接加以鉴别,适合乳制品突发事件情况中的检测。     

益生菌制品中植物乳杆菌ST-III快速定性、定量检测方法的建立

【目的】建立快速定性、定量检测益生菌产品中植物乳杆菌菌株ST-III的方法,为其实际应用提供参考。【方法】根据植物乳杆菌菌株ST-III与NCBI库中3株已知序列的植物乳杆菌全基因组序列差异,设计菌株特异性引物,进行菌株特异性PCR验证和定性检测;然后建立荧光定量PCR,并检测益生菌制品中菌株ST-III含量。【结果】设计的引物具有良好的菌株特异性;经PCR扩增,含有ST-III的检验样本出现预期特征条带,与预期目的片段（242 bp）相近。建立的荧光定量PCR标准曲线方程为y=-3.369lgx+39.84,R2为0.9990,符合Real-time PCR定量的要求,其检测限为2.85×103 CFU/mL。经检测,样品中植物乳杆菌ST-III的数量分别为3.25×105、1.28×106、4.55×106 CFU/mL。【结论】建立的植物乳杆菌菌株ST-III定性、定量检测方法快速灵敏、测定时间短,可以在实际生产中应用。     

荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的建立及应用

为了检测食品中金黄色葡萄球菌,建立一种基于SYBR GreenⅡ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法。根据金黄色葡萄球菌nuc基因,设计特异引物,优化引物退火温度,检测了特异性和灵敏性,建立了荧光定量PCR检测方法,并利用此方法对肉类和乳制品中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明:建立qPCR方法具有很好的特异性,其灵敏度可达到3.5×101 CFU/mL,检测到的循环阈值(Cycle threshold,Ct)与金黄色葡萄球菌菌液浓度有良好的线性方程,相关系数R2为0.9997,在肉类和乳制品中金黄色葡萄菌的检测限分别为4.0×101,3.5×101 CFU/mL。试验证明建立的荧光定量PCR检测方法能够快速准确地检测食品中的金黄色葡萄球菌。     

多重PCR方法检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌

通过扩增霍乱弧菌(VC)、副溶血性弧菌(VP)和单核细胞增生李斯特氏菌(LM)的特异性核酸片段,建立了VC、VP和LM的多重PCR检测方法,相应的扩增片段分别为588、450、234 bp。该方法特异性强、灵敏度高、简便、快速,可实现对上述致病菌的同时检测,在接种食品中检测灵敏度达到103 CFU/mL。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制

【目的】建立一种可快速检测单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法。【方法】用自制的单核增生性李斯特菌作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,之后通过杂交瘤技术进行细胞融合制备出特异性良好的单克隆抗体,并通过双抗夹心ELISA体系筛选出2株稳定且配对最佳的抗体,利用胶体金免疫层析技术组装试纸条并分析其特性。【结果】筛选出的2株单抗命名为3B7、5C9,测得其灵敏度均为10~4 CFU/mL,抗体的最适pH值是8.0,最佳抗体标记是24μg,试纸条的灵敏度为10~6 CFU/mL且特异性良好。【结论】初步制备出可快速、准确检测冷鲜猪肉中单增李斯特菌的试纸条。     

奶牛乳样和粪样中幽门螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种特异、灵敏的牛源幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)检测方法,为家畜感染幽门螺杆菌的流行病学调查鉴定提供支持。【方法】分别选取Hp的16SrRNA、UreA、glmM为靶基因设计特异性引物,以H.pylori动物模型适应菌株SS1株为标准菌株建立PCR检测方法,并进行PCR条件优化,运用所建立的最优PCR方法检测临床奶牛乳样和粪样中Hp的分布情况。【结果】PCR特异性试验结果显示,仅Hp SS1株能扩增出特异性条带,而对照菌株金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌均无扩增条带。PCR灵敏度试验结果显示,16SrRNA、UreA、glmM基因在乳样中的最低检出浓度分别为101,103和103CFU/mL,在粪样中的最低检出浓度分别为101,104和104 CFU/mL。应用该PCR方法对采集自规模化养殖场及散养的共计41头奶牛的乳样和粪样进行检测,成功检出Hp DNA,靶基因16SrRNA、UreA和glmM序列与NCBI上所发表的J166和ATCC43504菌株序列的同源性均达98%以上。【结论】成功建立了特异、灵敏的牛源Hp的PCR检测方法,可以应用于临床奶牛乳样和粪样中Hp的检测。     

冷藏对虾中腐败希瓦氏菌活菌EMA-qPCR检测方法的建立

【目的】将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合,建立快速检测腐败希瓦氏菌活菌的方法。【方法】用不同浓度的EMA和作用时间优化对腐败希瓦氏菌活菌的EMA-qPCR检测方法。研究该方法对活菌的最低检出限及能抑制死菌DNA扩增的最高浓度。研究该检测方法对不同比例死、活腐败希瓦氏菌的检测效果。用10株不同细菌验证该方法的特异性。检测101尾冷藏南美对虾中的腐败希瓦氏菌,并用平板培养法和qPCR方法对结果进行验证。【结果】EMA-qPCR检测最优方法为用终浓度20μg/mL的EMA处理细菌20 min。建立的EMA-qPCR法能够最低检测活菌的浓度为1 CFU/反应,能有效抑制1.0×10~7CFU/反应腐败希瓦氏菌死菌细胞DNA的扩增。对于死活混合菌,EMA-qPCR能够选择性扩增活菌DNA。该检测方法特异性良好。EMA-qPCR、平板培养和qPCR分别在16、12和19尾对虾中检测到腐败希瓦氏菌。【结论】EMA-qPCR检测技术能够快速、准确的区分腐败希瓦氏菌死菌和活菌,可作为水产品中腐败希瓦氏菌活菌的新检测方法。     

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。     

肉羊源单核细胞增生李斯特菌及空肠弯曲菌的临床监测

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)及空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)均为人兽共患病原菌,与动物源食品卫生安全密切相关。为保障肉羊源食品安全,对江苏地区部分羊场的这2种细菌进行临床监测。通过对单核细胞增生李斯特菌hly基因及空肠弯曲菌gyrA基因的序列分析,选择其保守区域设计2对引物。通过对参考菌株的PCR扩增及PCR产物的序列测定,证明所建立的PCR方法可特异性检测单核细胞增生李斯特菌及空肠弯曲菌。采集江苏地区12个养殖场的肉羊肛拭子样品共199份,并接种含10%小牛血清的液体肉汤进行增菌培养。增菌物以煮沸法制备细菌DNA模板后,以建立的PCR方法对空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特菌进行检测。结果发现其中2个养殖场(2/12)存在单核细胞增生李斯特菌感染,4个养殖场(4/12)存在空肠弯曲菌感染。在被检的199份样品中,有2份(1.01%)为单核细胞增生李斯特菌阳性,12份(6.03%)为空肠弯曲菌阳性。     

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法研究进展

单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,广泛分布于自然界。针对目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测现状,总结了4种现行有效的常用检测方法,并对各种检测方法的优缺点进行了分析比较。实时荧光定量PCR检测技术,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,不需要凝胶电泳过程,避免了扩增产物对环境造成的污染问题,将是未来分析检测发展的一个主要趋势。     

应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL~(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg~(-1)、水和牛奶为400cfu·L~(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。