山羊前体脂肪细胞的培养及生物学特征研究

采用组织块培养法对山羊皮下前体脂肪细胞进行原代和传代培养,并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂肪含量测定.结果表明:培养的原代细胞经传代后成分均一,细胞贴壁生长,呈短梭状或棱形,经诱导培养后细胞充脂率高,脂滴可被油红O染色,具有前体脂肪细胞的典型特征.     

八眉猪肌内前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

以域型胶原酶消化5日龄八眉猪仔猪背最长肌组织,分离肌内前体脂肪细胞,经差速贴壁法纯化后接种培养,以RT-PCR 和油红O 染色法对分化前后的细胞进行鉴定,通过观察细胞形态变化,细胞贴壁率测定,及用MTT法检测增殖活性,油红O染色提取法检测成脂诱导分化过程中细胞脂肪含量的变化,分析前体脂肪细胞生长特性和分化能力。结果表明,分离的八眉猪肌内前体脂肪细胞呈梭状、形似成纤维细胞,贴壁性能好,贴壁率最高可达90%;细胞生长良好增殖曲线呈“S”型,符合正常的细胞生长规律;肌内前体脂肪细胞体外自发分化能力弱,但经成脂诱导,可以分化为具有脂肪细胞典型特征的成熟脂肪细胞,分化水平以时间依赖方式显著提高。     

牛前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前体脂肪细胞分化的早期开始表达,PPAR-γ在分化的中期开始高度表达,而脂联素在牛前体脂肪细胞分化的前期未检测到,在细胞分化后期高度表达。【结论】用Ⅰ型胶原酶消化法可获得大量的牛前体脂肪细胞。培养的牛前体脂肪细胞成分均一、生长旺盛,经胰岛素诱导后能稳定的向脂肪细胞分化。     

Chemerin调控牛肌内成熟脂肪细胞脂解的作用机制

[目的]本试验旨在分析脂肪自分泌因子Chemerin在牛肌内成熟脂肪细胞脂解中的作用及调控机制。[方法]体外培养牛肌内成熟脂肪细胞,采用油红O染色与抽提法检测成熟脂肪细胞脂解过程中脂肪含量变化,通过比色法测定细胞中甘油及游离脂肪酸的释放量;采用RT-q PCR及Western blot技术分析脂解关键基因PPARα、LPL与HSL mRNA及蛋白的表达情况。[结果]在牛肌内成熟脂肪细胞脂解过程中,细胞中Chemerin及其受体CMKLR1 mRNA表达量显著降低(P0.05);Chemerin处理牛肌内成熟脂肪细胞后,细胞内脂肪含量减少,成熟脂肪细胞快速脂解为去分化的前体脂肪细胞,细胞中甘油和游离脂肪酸的释放量增加。脂解关键基因PPARα、LPL与HSL mRNA及蛋白表达水平与对照组相比极显著升高(P0.01)。[结论]Chemerin通过上调脂肪细胞脂解关键基因表达,促进了牛肌内成熟脂肪细胞中脂肪的分解,进而可降低肌内脂肪含量。     

FSP27基因对猪前体脂肪细胞增殖、分化和凋亡的影响

为研究FSP27基因对猪前体脂肪细胞增殖、分化和凋亡的影响,在军牧一号白猪原代前体脂肪细胞中转染siRNA-717沉默FSP27.猪前体脂肪细胞分化效果使用油红O染色试验检测,猪前体脂肪细胞增殖、分化、凋亡相关基因的表达使用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹等技术检测.结果表明:猪脂肪细胞中转染 siRNA-FSP27后,PCNA,cyclin D2和 cyclin E2的 mRNA 表达水平显著升高;aP2、C/EBPα、PPARγ的mRNA表达水平显著降低;油红O检测结果显示脂滴显著降低;Bax和p53的相对mRNA水平显著降低,Bcl2显著升高.表明FSP27在体外培养的猪脂肪细胞中抑制脂肪细胞增殖,促进脂肪细胞分化和凋亡.     

松辽黑猪前体脂肪细胞分离及诱导分化

为建立松辽黑猪前体脂肪细胞分化体系,了解其增殖规律及相关的脂肪标志基因在细胞分化过程中的相对表达。选用7日龄松辽黑猪,用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织得到前体脂肪细胞,传代后进行形态学观察并绘制生长曲线,利用传统"鸡尾酒"法进行诱导分化,油红O对分化后的细胞进行染色,判断分化效果,提取总RNA,对成脂标志基因进行相对表达量分析。结果表明:分离获得的松辽黑猪原代前体脂肪细胞可贴壁生长,形似成纤维细胞,细胞生长曲线符合细胞生长规律,近似"S"形;诱导分化后的细胞具有成熟脂肪细胞的典型特征,细胞内聚集大量脂滴;诱导后第10天,细胞内甘油三酯含量极显著提高;成脂标志基因PPARγ、C/EBPα在分化后的细胞中相对表达量极显著升高(P0.01),而FoxO1在分化前相对表达量最高,第5天表达量与第0天相比极显著下降(P0.01),但第10天的表达量极显著高于第5天(P0.01),且第10天表达量与第0天无显著差异(P0.05)。试验建立了松辽黑猪前体脂肪细胞的分离体系,为进一步研究松辽黑猪脂肪沉积与代谢机制以及改善肉质提供了依据。     

ICR小鼠肥胖模型的建立以及肥胖指标和脂肪组织形态学比较

[目的]建立ICR小鼠肥胖模型,并比较肥胖型小鼠与对照组小鼠脂肪组织形态学的差异。[方法]以ICR小鼠为研究对象,饲喂高脂日粮构建肥胖模型,测定其体重、脂肪组织湿重和脂肪系数,并进行比较。[结果]雌性和雄性小鼠肥胖造模的成功率分别为16.67%和66.67%。用高脂日粮饲喂60 d后肥胖小鼠脂肪细胞体积明显增大,肥胖型小鼠体重、脂肪组织湿重和脂肪系数与对照组相比均存在极显著差异﹙P0.01﹚。[结论]该研究为ICR小鼠肥胖模型的建立以及脂肪组织的形态学研究提供依据。     

北京油鸡骨骼肌SV细胞成脂诱导分化的研究

[目的]建立肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞的共培养体系。[方法]用10μg/ml INS、1μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX对北京油鸡肌肉SV细胞进行诱导后,通过油红染色法、细胞免疫学鉴定及关键基因的表达对诱导的SV细胞进行分析。[结果]油红O脂肪染色法鉴定结果表明,诱导后的细胞红色脂质密度较高,说明SV细胞经过诱导后含有更多的前体脂肪细胞。通过实时荧光PCR定量检测细胞发育的标志性基因,发现诱导与未诱导的肌肉SV细胞均会表达前体脂肪细胞标志性基因。[结论]肌肉SV细胞经过诱导后前体脂肪细胞的含量得到提高,有利于建立前体脂肪细胞和肌卫星细胞的体外培养体系。     

延黄牛前体脂肪细胞的培养及生物学特性研究

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的mRNA在延黄牛前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果表明:经过分离的延黄牛原代脂肪细胞可贴壁生长,传代后成分均一贴壁良好,呈带角的梭型、形似成纤维细胞;第2天开始细胞进入对数生长期,第4天以后为细胞生长的平台期,增殖速度明显变慢,细胞生长曲线近视"S"形,符合正常的细胞生长规律;经诱导分化后的细胞可被油红O染色,呈现典型的圆形脂滴,具有成熟脂肪细胞的典型特征;甘油三酯含量在第0~4天变化缓慢,在第4天以后显著升高;成脂标志基因PPARγ、C/EBPα随着分化过程的进行,在分化早期显著上升,随着分化进程的结束略有下降。综上所述,本研究成功建立了延黄牛前体脂肪细胞的分离培养方法,为进一步研究延黄牛脂肪沉积作用机制以及改善牛肉品质奠定了基础。     

ChREBP基因siRNA表达质粒构建及对原代 培养猪脂肪细胞生脂的影响

【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

[目的]探讨在生化培养箱中进行奶牛乳腺上皮细胞原代培养的可行性。[方法]采用组织块法,在体外进行乳腺上皮细胞的分离培养,探索其在生化培养箱中合适的培养条件。用倒置显微镜观察、细胞爬片吉姆萨染色和角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。[结果]通过倒置显微镜观察发现,上皮细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有铺路石样。细胞染色可见上皮细胞胞体较大,胞核深蓝色,圆形或椭圆形,核仁清晰可见,一般为2-4个。免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白14和18。[结论]原代奶牛乳腺上皮细胞可以在生化培养箱中成功培养。     

罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响

[目的]探讨罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响。[方法]利用胶原酶消化法分离了猪皮下前脂肪细胞,采用3种不同分化培养液对猪前脂肪细胞进行了诱导分化,借助油红O染色提取法比较了不同分化培养液对分化过程中细胞内脂肪含量变化的影响,并运用实时定量RT-PCR方法检测了不同分化培养液细胞分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的变化趋势。[结果]细胞内脂肪聚积以含罗格列酮的MⅡ最快,不含罗格列酮的MⅠ最慢。罗格列酮可极显著上调PPARγ基因的表达（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达存在一定的抑制作用,但不显著。血清对PPARγ基因的表达有极显著的上调作用（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达有极显著下调作用（P〈0.01）。[结论]罗格列酮可极大地促进PPARγ基因的表达,继而增进细胞内脂肪沉积;血清中可能存在PPARγ基因的激活剂,同时存在PPARα基因的抑制因子。     

罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响

[目的]探讨罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响。[方法]利用胶原酶消化法分离了猪皮下前脂肪细胞,采用3种不同分化培养液对猪前脂肪细胞进行了诱导分化,借助油红O染色提取法比较了不同分化培养液对分化过程中细胞内脂肪含量变化的影响,并运用实时定量RT-PCR方法检测了不同分化培养液细胞分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的变化趋势。[结果]细胞内脂肪聚积以含罗格列酮的MⅡ最快,不含罗格列酮的MⅠ最慢。罗格列酮可极显著上调PPARγ基因的表达（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达存在一定的抑制作用,但不显著。血清对PPARγ基因的表达有极显著的上调作用（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达有极显著下调作用（P〈0.01）。[结论]罗格列酮可极大地促进PPARγ基因的表达,继而增进细胞内脂肪沉积;血清中可能存在PPARγ基因的激活剂,同时存在PPARα基因的抑制因子。     

1株多粘类芽孢杆菌产菊粉酶粗酶学性质的研究

[目的]研究1株多粘类芽孢杆菌所产菊粉酶的粗酶学性质。[方法]以菊芋菊粉为底物发酵培养了1株多粘类芽孢杆菌,利用超声波法破碎细胞,得到该菌的菊粉酶粗提液,并对菊粉酶的粗酶学性质进行了研究。[结果]这株多粘类芽孢杆菌最佳产酶时间约在摇瓶发酵培养40h时,所产的胞内菊粉酶的菊粉酶活力与蔗糖酶活力之比（I/S）为0.2187,小于10,表现为外切酶活性。该酶反应的最适温度和最适pH值分别为45℃和5.0,在此条件下菊粉酶酶活力最高,可达102.81U/L。[结论]这株多粘类芽孢杆菌所产菊粉酶为外切酶,该酶的粗酶学性质研究为进一步深入系统地研究菊粉酶的酶学性质奠定了基础。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA,并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板,根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物,用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后,与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA,该片段长1577bp,编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异,同源性为98％;而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成,序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。     

松辽黑猪脏器总RNA提取方法的改进及应用

[目的]改进松辽黑猪脏器总RNA的高效快速提取方法,为检测脏器组织RNA提供基础。[方法]采用液氮研磨,利用Trizol使细胞膜破裂,并通过氯仿、异丙醇、无水乙醇处理,使RNA与杂质分离,得到高质量的RNA。[结果]得到的松辽黑猪脏器总RNA浓度和纯度都比较高,并且未被降解。[结论]该方法提取的RNA质量没有DNA污染、纯度高、没有降解、完整性好,稳定可靠,并且用时少。     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

发酵条件对猪场粪肥肥效的影响

[目的]研究发酵条件对粪肥发酵的影响。[方法]研究发酵时间、发酵季节、复合菌剂添加量对猪场粪肥发酵效果的影响。通过作物种植试验,并与化肥和沼液进行比较,验证猪场粪肥的肥效。[结果]粪肥发酵时间以7 d左右较好,肥效元素含量可达最大值;夏季发酵效果较好,粪肥中铵态氮和硝态氮含量增幅最大;向粪肥中添加复合菌剂有助于发酵。猪场粪肥与化肥具有相当的肥效。[结论]发酵时间、发酵季节及复合菌剂可影响猪场粪肥发酵的肥效,在生产中应予以重视。     

Cu~(2+)对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响

[目的]了解重金属对栉孔扇贝的毒理效应。[方法]在DMEM培养液中分别添加质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L的Cu2+,以细胞迁出时间和组织块增殖状况为评价指标,研究Cu2+对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响。[结果]栉孔扇贝外套膜在DMEM培养液中贴壁良好。培养至72 h时,Cu2+质量浓度为0.05 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况良好。培养至89 h时,Cu2+质量浓度为0.10 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况较差。随着Cu2+质量浓度的增大,细胞迁出所需的时间越长,组织块增殖情况越差。Cu2+质量浓度为0.40 mg/L的实验组,培养96 h时并没有游离细胞迁出。[结论]Cu2+质量浓度大于0.10 mg/L时对栉孔扇贝外套膜的组织培养有一定的抑制作用。