气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的参考序列,采用PCR方法扩增细胞毒素CctA基因。在将该基因进行克隆和测序后利用生物信息学方法,对细胞毒素CctA蛋白的理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与参考序列(JQ692583)相比,存在3处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为99.4%;CctA蛋白的理论等电点为8.00,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,主要有4个抗原表位区域。本研究为CctA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础。     

延黄牛前体脂肪细胞的培养及生物学特性研究

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的mRNA在延黄牛前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果表明:经过分离的延黄牛原代脂肪细胞可贴壁生长,传代后成分均一贴壁良好,呈带角的梭型、形似成纤维细胞;第2天开始细胞进入对数生长期,第4天以后为细胞生长的平台期,增殖速度明显变慢,细胞生长曲线近视"S"形,符合正常的细胞生长规律;经诱导分化后的细胞可被油红O染色,呈现典型的圆形脂滴,具有成熟脂肪细胞的典型特征;甘油三酯含量在第0~4天变化缓慢,在第4天以后显著升高;成脂标志基因PPARγ、C/EBPα随着分化过程的进行,在分化早期显著上升,随着分化进程的结束略有下降。综上所述,本研究成功建立了延黄牛前体脂肪细胞的分离培养方法,为进一步研究延黄牛脂肪沉积作用机制以及改善牛肉品质奠定了基础。     

绵羊VEGF-B基因可变剪切体克隆与鉴定

为克隆绵羊血管内皮生长因子B(VEGF-B)基因,探寻该基因与毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,本文利用RT-PCR从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-B基因mRNA并对不同组织中VEGF-B基因表达进行分析。扩增显示存在2条扩增条带,克隆测序发现均为VEGF-B基因,大小为978 bp和877 bp。分析发现片段中间部位缺失导致编码氨基酸序列改变,但并未破坏PDGF功能结构域,仅引起一端蛋白酶切位点改变。不同组织器官中两突变体表达检测发现具有组成型表达的特点。定量检测发现VEGF-B在肺脏和卵巢组织中较心脏组织表达升高,脾脏、肾脏与心脏表达持平。肠道、肝脏、脑及肌肉组织则表达降低。本研究成功克隆了绵羊VEGF-B基因并对其进行了系统的鉴定分析,为进一步研究绵羊VEGF家族功能奠定基础。     

葛根素对延黄牛原代脂肪细胞分化的影响

为探究葛根素对牛前体脂肪细胞分化的调控作用,在脂肪形成过程中将葛根素加入到培养基中,观察其对成脂分化的影响。分别采用油红O染色法及甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中的脂滴积聚及细胞内的甘油三酯含量;采用qRT-PCR和Western blot技术检测成脂分化过程中脂肪形成相关转录因子CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA和蛋白的表达水平。结果表明:低浓度的葛根素能促进脂肪细胞的分化,增加细胞内的甘油三酯含量,促进成脂标志基因的mRNA及蛋白的表达。葛根素的添加可促进脂肪分化,增加脂肪沉积,这为进一步研究延黄牛脂肪沉积作用机制以及改善牛肉品质奠定基础。     

吉林延边地区牛气肿疽病的诊断报告

本研究旨在对吉林省延吉市三道湾镇两位农户饲养的病死黄牛进行快速诊断。本试验采集肝脏、脾脏、心脏、肌肉等组织,通过流行病学调查、临床剖检、显微镜观察、细菌培养观察、生化试验、分子生物学试验及动物试验进行气肿疽病诊断。病死黄牛的肌肉部位触压有捻发音,切面有大量血液和气泡流出,镜检可见两端钝圆、有芽孢的大杆菌,在肝片肉汤培养基中形成上清清朗、底部有松散的白色沉淀,生化试验均呈现气肿疽厌气菌所特有的产酸产气反应,PCR扩增出大小为501 bp的特异性条带。结果表明延边地区两病死黄牛感染了气肿疽病,证明了该地区气肿疽梭菌的存在。本试验首次分离鉴定出气肿疽梭菌延边株,为该地区气肿疽病的诊断和防制提供了重要的参考依据,同时为进一步研究该病的药物防制和免疫防制奠定了重要基础。     

葛根素对Akt通路调控3T3-L1脂肪细胞分化的影响

为了研究葛根素(puerarin)对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响,探索其在成脂分化过程中的潜在作用机制,试验在脂肪形成过程中将0、10、50μmol/L葛根素加入到诱导分化培养基中诱导分化,分别通过油红O染色法及甘油三酯酶法检测葛根素对3T3-L1脂肪细胞的脂滴积累、甘油三酯的影响;采用实时荧光定量PCR检测脂肪细胞中CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达量,Western blotting检测脂肪形成相关转录因子及Akt信号通路的蛋白水平的表达量。结果表明,10μmol/L葛根素极显著增加了成熟脂肪细胞中脂滴和甘油三酯(TG)的积聚,极显著促进了脂肪形成相关转录因子C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白水平的表达量(P0.01)。进一步研究发现,与对照组相比,葛根素的刺激可增强Akt信号通路Ser473蛋白的磷酸化表达水平,表明葛根素对成脂分化过程的促进作用很大程度上是通过Akt信号通路的磷酸化来实现的。综上所述,葛根素能够促进3T3-L1前体脂肪细胞的分化,改善胰岛素敏感性,其作用机制与激活Akt信号通路Ser473位点的磷酸化水平有关。本试验结果可为研究胰岛素的效应机制提供新见解,为胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新思路。     

葛根素对Akt通路调控3T3-L1脂肪细胞分化的影响

为了研究葛根素（puerarin）对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响,探索其在成脂分化过程中的潜在作用机制,试验在脂肪形成过程中将0、10、50 μmol/L葛根素加入到诱导分化培养基中诱导分化,分别通过油红O染色法及甘油三酯酶法检测葛根素对3T3-L1脂肪细胞的脂滴积累、甘油三酯的影响;采用实时荧光定量PCR检测脂肪细胞中CCAAT-增强子结合蛋白α（C/EBPα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的mRNA表达量,Western blotting检测脂肪形成相关转录因子及Akt信号通路的蛋白水平的表达量。结果表明,10 μmol/L葛根素极显著增加了成熟脂肪细胞中脂滴和甘油三酯（TG）的积聚,极显著促进了脂肪形成相关转录因子C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白水平的表达量（P<0.01）。进一步研究发现,与对照组相比,葛根素的刺激可增强Akt信号通路Ser473蛋白的磷酸化表达水平,表明葛根素对成脂分化过程的促进作用很大程度上是通过Akt信号通路的磷酸化来实现的。综上所述,葛根素能够促进3T3-L1前体脂肪细胞的分化,改善胰岛素敏感性,其作用机制与激活Akt信号通路Ser473位点的磷酸化水平有关。本试验结果可为研究胰岛素的效应机制提供新见解,为胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新思路。