延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息学分析

根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与AB058932序列相比,存在38处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为97%;FliA蛋白的理论等电点为6.99,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,主要有15个潜在B细胞抗原表位区,17个限制性CTL抗原表位区。本试验为延边株气肿疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基础。     

猪附红细胞体膜蛋白OxaA全长基因的克隆及结构功能预测

为了解猪附红细胞体膜蛋白OxaA的生物学特性,本研究设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增OxaA 基因的全长序列,进行克隆和测序,并采用生物信息学方法,对OxaA蛋白的分子结构、理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析.结果表明:PCR扩增出了1561 bp的目的片段；经测序OxaA核苷酸序列与GenBank中KI_3806(NC_015153)基因组序列相比,存在21处同义突变,核苷酸序列同源性98％,氨基酸序列同源性100％；OxaA蛋白的理论等电点为9.98,偏碱性；OxaA蛋白存在多个信号肽可能位点和5个跨膜区域；OxaA蛋白的二级结构以α螺旋、不规则卷曲、延伸链为主要构件；SWISS数据库中并未找到与OxaA蛋白结构高度相似的蛋白,应用CPHmodels模拟出OxaA蛋白的三级结构；OxaA蛋白的B细胞抗原表位可能存在于20～24位、28～40位、45～53位、142～150位、260～ 263位氨基酸处.本研究为OxaA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为猪附红细胞体病单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒结构蛋白基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

[目的]以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据,应用生物信息学相关软件和方法,对BVDV结构蛋白( Structural Protein,SP)的二级结构的不同方面及其B细胞表位进行了预测,综合评价了BVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位,并计算出一些潜在的抗原位点.[方法]利用RT- PCR扩增法获得牛病毒性腹泻病毒结构蛋白序列,通过克隆、测序分析结构蛋白基因的基因组序列和蛋白序列,采用DNAStar Protean软件对结构蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布.[结果]P14、gp48和gp53蛋白含有的细胞优势抗原表位较多,有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用.[结论]与已鉴定的B细胞抗原表位相比,试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法.     

D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白结构及抗原表位分析

利用生物软件对D型产气荚膜梭菌ε毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析。综合ε毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B细胞抗原表位,三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153抗原表位区内。     

猪源Bb SC-SN株的分离鉴定及其皮肤坏死毒素（DNT）全基因序列分析

【目的】了解当前支气管败血波氏杆菌(Bb)地方菌株皮肤坏死毒素(DNT)基因的变异特点。【方法】利用分离培养、PCR及16SrRNA扩增片段同源性分析,对采自四川遂宁某规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状的鼻拭子进行病原分离鉴定,并对分离株的DNT基因进行克隆和序列分析,对其抗原域、氨基酸二级结构、特定区域位于蛋白质表面可能性等参数进行预测,分析其B细胞抗原表位。【结果】成功分离得到一株支气管败血波氏杆菌,命名为支气管败血波氏杆菌SC-SN株。分离株DNT基因序列全长4 357bp,与其他11株菌DNT基因的核苷酸序列同源性为93.1%~100.0%,但由于其356位插入碱基A,使得该序列仅编码1 426个氨基酸,与上述11株DNT基因编码的氨基酸序列同源性仅为12.8%~47.0%。遗传进化树显示,SC-SN分离株与S798日本株和未知1株的亲缘关系最近。软件预测结果显示,Bb SC-SN株DNT基因编码氨基酸B细胞抗原表位发生较大变化。【结论】经鉴定,分离株确为支气管败血波氏杆菌,且SC-SN株的DNT基因序列变异较大,第356位插入的碱基A,对其氨基酸序列、ORF及B细胞抗原表位分布产生了较大的影响。     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

牛流行热病毒山东分离株α3基因序列分析及原核表达与纯化

为深入研究牛流行热病毒(BEFV)编码的α3非结构蛋白的功能及其在研发新型BEFV疫苗和诊断试剂上的应用,本研究对本实验室分离保存的BEFV采用RT-PCR法对其α3基因进行扩增;用DNAStar软件对序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;用ProtParam和抗原表位分析生物信息学软件研究α3蛋白的亲水性、优势抗原表位区;分别用限制性内切酶双酶切目的基因α3和pGEX-4T-1载体,构建pGEX-4T-1-α3原核表达载体,并进行诱导表达。结果表明,成功扩增出156 bp的α3基因序列;该α3基因序列与参考毒株的核苷酸序列同源性为98.0%~100.0%,氨基酸序列的同源性也为98.0%~100.0%,表明α3蛋白具有较高的保守性;BEFV的α3蛋白抗原表位分析表明3~5、9~47 aa是α3蛋白的优势抗原表位区段,总平均疏水性为-0.737,说明该蛋白以可溶性形式存在;构建的pGEX-4T-1-α3原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达,应用可溶性蛋白纯化的方法获得较高纯度的α3蛋白。本研究为该蛋白的免疫原性验证以及新型牛流行热病毒疫苗研发提供了数据参考。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

C型产气荚膜梭菌β毒素蛋白结构及抗原表位预测

利用DNASTAR、I-Tasser软件对C型产气荚膜梭菌β毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析.综合β毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,B细胞抗原表位可能位于肽链2~4、7~16、23~26、36~40、55~58、72~75、172~179、190~193、196~203、211~214、246~249位氨基酸区域;结合三级结构预测结果显示,190~193、211~214成为表位的可能性较大.     

生物信息学对扩展莫尼茨绦虫cDNA文库Cavβ基因分析与B细胞抗原表位预测

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)电压门控钙通道β亚基(cavB)基因,预测蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨Cavβ在寄生虫病治疗中所起的作用.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取全长cDNA序列;采用生物信息学方法对其对应的蛋白进行二级结构和B细胞抗原表位的预测.[结果]获得扩展莫尼茨绦虫Cavβ基因,全长946 bp,编码180个氨基酸,理论分子质量为19.788 8 kD,等电点为5.06,属于Ca_channel_B超家族.二级结构以无规则卷曲为主,结构预测存在4个可能的B细胞抗原表位.[结论]研究对于扩展莫尼茨绦虫Cavβ基因的获得和B细胞抗原表位的预测,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定了基础.