对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80 ℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。      

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的底物制备及酶学特性研究

采用原核表达体系和HPLC法,分别获得肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)及其反应底物———香豆酰CoA酯,并对CCR酶学特性进行研究分析。结果表明,通过酶学方法和HPLC的分离纯化能够得到较高浓度和纯度的CCR反应底物;重组毛白杨CCR的最适反应温度是37℃,最适pH值为6.25,Km值为5.664μmol/L,Vmax为4.09 nmol/Ls。     

植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展

综述了4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的功能、功能与结构的关系及晶体学方面的研究进展,以期为4CL蛋白质的结构和功能的进一步研究提供依据。     

毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶338Val缺失突变分析

通过对毛白杨中的4--香豆酸:辅酶A连接酶1（Pt4CL1）蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pt4CL1蛋白突变体338dVal。与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是(162±034) nkat/mg。同时,对4--香豆酸催化活性有轻微的降低（约降低12％）,对咖啡酸的催化活性有明显增加（约增加126％）,对阿魏酸的催化活性有部分的降低（约降低29％）,对肉桂酸的催化活性没有显著变化。该结论证实了第338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应。该项研究为通过基因工程技术调控木质素的合成提供了新的方法。      

GRP1.8-反义pt4CL1基因对巨尾桉 木质素含量的影响

桉树是桃金娘科桉树属(Eucalyptus）植物的统称,是制浆造纸的主要原料之一,但是桉树中含有大量木 质素,木质素的存在会严重影响纸浆的质量。4-香豆酸颐辅酶A 连接酶(4CL）是木质素单体生物合成的关键酶之一, 抑制4CL 基因的表达,可以有效降低植物中木质素的含量。通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将形成层定位启动 子GRP1.8 融合的杨树反义4-香豆酸:辅酶A 连接酶基因导入巨尾桉,经卡那霉素筛选和PCR 鉴定,获得9 株转基 因阳性植株。通过4CL 酶活性测定和木质素、纤维素含量的分析,发现转基因组培苗的4CL 酶活性比对照植株下降 了44%,温室转基因幼苗中硫酸木质素含量下降了16%。     

毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。      

茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆得到Cs4CL1基因,该基因长度为1 715 bp,开放阅读框长度1 623 bp,编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示,Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征,即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示,Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类,属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白,该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。     

枯草杆菌脂肪酶固定化与酶学特性的初步研究

以枯草杆菌突变菌株所分泌的脂肪酶为研究对象,以人造沸石为载体,以戊二醛为交联剂,采用交联-吸附法固定脂肪酶,对固定条件和酶学特性进行了分析.结果表明:固定过程中交联剂最适浓度为3%,固定化酶最适反应温度为40℃,比游离酶高5℃,游离酶和固定化酶最适pH值均为8.0.固定化酶在最适温度下保温100 min后几乎没有酶活损失,重复反应5个批次后,酶活仍保留70%,说明采用该方法固定的脂肪酶具有较好的热稳定性和操作稳定性.     

烟草绿原酸生物合成途径关键酶基因的研究进展

绿原酸是重要的植物苯丙素类次生代谢产物之一,与植物的食品风味和药用生物活性等密切相关,其生物合成与调控研究一直是科研人员所关注的焦点。本文综述了烟草绿原酸生物合成途径中关键节点苯丙氨酸解氨酶基因、肉桂酸-4-羟化酶基因、对-香豆酸辅酶A连接酶基因、羟基肉桂酰辅酶A:奎尼酸羟基肉桂酰转移酶基因、羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶基因、对-香豆酸3′-羟化酶基因的研究进展,并进一步展望了烟草绿原酸生物合成代谢调控的研究方向,旨在为烟草绿原酸生物合成途径的深入研究和定向调控提供参考。     

米酒凝乳酶酶学性质研究

采用乙醇沉淀法提取米酒中凝乳酶的粗酶液,对其酶学性质进行了分析.试验结果表明:米酒中凝乳酶的最适反应温度为60 ℃,但该温度条件下的酶活稳定性较差,60 ℃下处理60 min,酶活性仅存15%.在实际干酪生产中,选择最适酶促反应温度45 ℃;米酒凝乳酶的最适反应pH值在4～5.5左右,此范围内具有较高的酶活稳定性;添加0.4 g/L CaCl2,间接加快酶促反应速率,增强凝乳硬度.     

粗糙脉孢菌GH45家族内切纤维素酶基因ncGH45在毕赤酵母中表达及重组酶的性质表征

纤维素酶作为一种重要的糖苷水解酶,在生物质能源生产、饲料、造纸、洗涤和纺织领域都有着非常广泛的应用。粗糙脉孢菌来源的GH45家族内切纤维素酶基因(nc GH45)全长935 bp,包含一个53 bp的内含子(339-391),编码272个氨基酸,包括一个N-端的GH45家族催化结构域和C-端的1家族碳水化合物结合结构域。该基因在毕赤酵母中得到了分泌表达,且表达蛋白条带单一,酶活性达到20 U/m L。重组酶r Nc GH45的最适p H为4.5~5.0,最适温度为60~65℃,并且在较宽的p H范围(p H 4.0~8.0)和温度范围(30~70℃)都能维持75%以上的酶活。在37℃和50℃,p H 3.0~11.0都有着非常好的稳定性;该酶的热稳定性非常好,在70℃和80℃处理2 h还能剩余89.6%和77.7%的酶活,即使在沸水中煮10 min还能剩余10%的酶活。r Nc GH45的最适底物是地衣多糖(1 116.0 U/mg),其次是大麦葡聚糖(754.2 U/mg)和CMC-Na(254.6 U/mg),对大麦葡聚糖和CMC-Na的动力学常数Km和Vmax分别为6.26 mg/m L和997.4μmol/mg·min,19.96 mg/m L和722.1μmol/mg·min。水解产物分析结果表明,r Nc GH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖,对寡糖的最小作用底物是纤维三糖,而对纤维二糖没有作用。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10 U时,减量率为1.55%。上述结果表明成功构建了r Nc GH45高效表达工程菌株,表达的重组蛋白性质优越,有着良好的工业应用前景。     

荔枝果肉过氧化物酶酶学性质研究

本文从荔枝果肉中提取了过氧化物酶(POD),对其酶学性质进行了研究.结果表明,该酶最适反应温度为45℃,对热较敏感,当温度为70℃以上时,短时处理即可使酶活降至50％以下.最适pH 5,但在pH6.0～8.0范围内活力比较稳定.该酶在25℃和0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)条件下对愈创木酚和没食子酸的Km值分别是4.64× 10-3和0.063 mol/L.谷胱甘肽和亚硫酸盐能完全抑制POD活性,但谷胱甘肽抑制浓度远低于亚硫酸盐,抗坏血酸只能在廷迟时间内抑制POD活性,对POD抑制具有暂时性,各抑制机制不同;CuSO4 、ZnSO4 、CaCl2 、MgCl2、EDTA对荔枝果肉POD活性有一定激活作用;FeSO4和MnSO4对POD活性有较强的抑制作用.     

花生种子脂肪氧化酶的活性测定研究

[目的]为了研究花生种子脂肪氧化酶的适宜测定条件。[方法]采用紫外分光光度法测定花生种子脂肪氧化酶的活性。[结果]结果表明:花生种子脂肪氧化酶最适反应体系为浓度0.10 mol/L pH值5.8的磷酸缓冲液和浓度0.20 mol/L pH值8.0的磷酸缓冲液;最适反应温度为35℃;最适酶液添加量为30μl;最适测定时间为1 min。此外,酶液保存在4℃条件下,脂肪氧化酶的活性随时间的延长而逐渐下降。[结论]该研究为进一步探讨花生种子脂肪氧化酶的生理功能奠定了基础。     

酶法水解非洲鲫鱼蛋白的优化工艺研究

以水解度和感官评价为指标,通过单因素和正交试验筛选酶法水解非洲鲫鱼的最佳工艺.结果表明:鲫鱼蛋白的较优水解酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,其中,木瓜蛋白酶对鲫鱼蛋白的较优水解条件是:60℃、pH6.0、料液比1∶5(w/v)、酶用量5%(w/w)、水解4.0 h;碱性蛋白酶的较优水解条件是:酶用量5%、料液比1∶3、65℃p、H 8.0、水解4.5 h;而双酶水解的优化工艺是碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1∶3(w/w)混合同时水解,酶用量为5%、料液比1∶5、55℃p、H 8.0、水解4.0 h,水解度最高达30.94%,制得的水解液清亮透明,气味较好,基本没有腥味和苦味.     

木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质

结果表明:最佳提取工艺条件为超声波功率300 W,超声处理时间200 s,果浆质量分数30%;经超声波强化提取,酶活力提高到原先的1.71倍;在以酪蛋白为底物、pH 7.5和40℃条件下,木瓜蛋白酶的Km值和Vm值分别为1.4709 mg.mL-1和5.5252μg.mL-1.m in-1;最适温度为70-80℃,最适pH值为5.4-6.6;该酶在40℃以下,pH为5.4-6.0时酶活力相对稳定;EDTA、Cys和Vc对酶活力具有激活作用,CuSO4和ZnC l2具有抑制作用,而KC l、NaC l、CaC l2、MgSO4对酶活力的影响不大.     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

鲜切山药中苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究

[目的]研究铁棍山药中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的动力学特性。[方法]以铁棍山药为研究对象,探讨铁棍山药切片后苯丙氨酸解氨酶的动力学特性,并考察底物浓度、pH、温度与酶浓度对酶活性的影响,筛选最优条件。[结果]PAL最适底物浓度为1mmol／L,底物浓度过高或过低都对酶活力不利。PAL在硼酸一氢氧化钠缓冲液中适宜的pH范围为7．6～9．2;最适pH有2个,分别为pH8．0和pH8．8。PAL适宜的温度范围为35—55℃,最适反应温度为45℃,超过70℃则容易钝化。经硫酸铵分级沉淀、透析和SephadexG-100凝胶过滤柱层析,纯化出苯丙氨酸解氨酶（PAL）,蛋白回收率为0．36％,酶回收率为3．1％,纯化倍数为3．76。[结论]该研究为解决市场新鲜山药易褐变的问题及提高山药的贮藏性提供了有效依据。     

Cladosporium tianshanense SL19来源的新型葡萄糖氧化酶的基因克隆及性质研究

葡萄糖氧化酶(GOX)已广泛应用于各种工业生产中。目前,除了曲霉和青霉属来源的GOX外,鲜有新型GOX被报道。经基因克隆和序列同源性分析,Cladosporium tianshanense SL19来源的葡萄糖氧化酶基因CtgoxB是一个新基因,该基因全长1 707 bp,无内含子,编码568个氨基酸,N-端第1～16个氨基酸为信号肽,与已报道的GOX序列最高一致性为35%。CtgoxB在毕赤酵母中实现异源表达,但重组蛋白CtGOXB未检测到GOX活性。通过序列和结构分析,同源重组构建的突变体CtGOXB-C1最终恢复了GOX活性。经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白CtGOXB-C1表观分子量约为120 kDa,大于理论分子量(61.6 kDa)。经酶学性质测定,CtGOXB-C1比活为123.8 U/mg,在pH 8.0和30℃条件下具有最高的酶活,且在10℃时依然维持65%的酶活,具有嗜低温特性。CtGOXB-C1在pH 6.0～9.0条件下保温1 h后,剩余酶活维持在80%以上,可以在中碱性条件下维持较高酶活,并且对表面活性剂SDS具有较强的抗性。这些性质表明CtGOXB-C1在水产饲料和洗涤剂等行业中具有良好的应用潜力。     

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。