尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

慈竹4CL基因的克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆慈竹木质素生物合成酶4CL基因,研究其序列特征,为今后利用该基因调控慈竹木质素的生物合成研究奠定基础。【方法】参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。【结果】成功克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1 674 bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在两大4CL氨基酸保守域(SSGTTGMPKGV和GEICIRG),其中前一个氨基酸保守域的第7个氨基酸位点变为M,与常见的L不同,表明慈竹的4CL基因发生了一定变异。系统进化分析表明,该基因(Na4CL)与水稻的Os4CL4和黑麦草的Lp4CL2具有很高的同源性。【结论】克隆了慈竹木质素合成酶4CL基因全长序列,在GenBank上注册为EU327341,可能与慈竹木质素生物合成有关。     

银杏4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆与序列分析

根据银杏(Ginkgo biloba L.)转录组中的基因序列设计引物,从银杏中克隆到了4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)的cDNA片段,命名为Gb4CL,GenBank登录号为KU820947。Gb4CL全长1736bp,含有1个1671bp的ORF,编码557个氨基酸。核苷酸和蛋白质序列多重比较结果显示,Gb4CL与其他植物的4CL基因的核苷酸与蛋白质序列均高度同源。Gb4CL编码的蛋白质与日本柳杉(Cryptomeria japonica)、白豆杉(Pseudotaxus chienii)、北美云杉(Picea sitchensis)的4CL氨基酸同源性分别为82%、83%、80%。4CL系统进化树显示,Gb4CL与裸子植物亲缘关系最近。该研究通过克隆Gb4CL基因,并进行相关的生物信息学分析,可为掌握银杏木质素生物合成中关键基因的调控机理提供参考。     

胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析

胡萝卜(Daucus carota L.)在NCBI(美国国家生物信息中心)上总共公布了13个4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)基因,而在芹菜转录数据中发现1个4CL基因,利用该基因序列设计1对克隆引物,成功得到1个新胡萝卜4CL基因,命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp,编码544个氨基酸,位于胡萝卜基因组第2染色体上。进化树分析显示,Dc4CL-1基因聚集在与木质素合成有关的4CLⅠ亚族。实时荧光定量PCR转录表达发现,在胡萝卜根生长发育期间,Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达,而在栽培胡萝卜中低表达。推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素合成有关。     

木质素生物合成酶4CL基因的遗传进化分析

【目的】4CL是木质素生物合成途径中的关键合成酶,通过对4CL基因的遗传进化分析,为其研究和利用提供理论依据。【方法】利用生物信息学手段,对4CL基因完整cDNA和编码氨基酸序列进行数据挖掘,利用Mega软件、ExPASy的Prosite数据库、NCBI的Conserved Domains数据库,进行4CL基因核酸和蛋白质水平上的遗传进化分析。【结果】构建了4CL基因的系统发生树,揭示出植物中的4CL基因聚类与植物分类大体一致,主要以基因家族的形式存在,但基因家族中部分基因存在着结构和功能的分化,4CL基因中存在着GC含量偏高和偏低两大类基因。4CL基因编码的氨基酸序列保守区高度相似,但是在单、双子叶两大类植物之间,其氨基酸平均含量存在着较大差异。【结论】在植物的进化过程中,虽然4CL基因较保守,但部分4CL基因发生了分化,体现在基因的结构和功能方面,在4CL基因的研究中必须充分考虑到这种分化。     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

反义4CL1基因转化烟草调控木质素生物合成

将控制木质素生物合成的关键限速酶 (香豆酸CoA连接酶 ,4CL)基因 4CL1反向插入植物表达载体pBI12 1构建表达载体 ,通过农杆菌叶盘法介导转化烟草 ,获得一批转基因抗性植株 .经PCR检测 ,证明 4CL1基因已成功反义转入到烟草植株中 .通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析 ,发现反义 4CL1基因转化植株的纤维素含量比对照提高了 11 4 % ,而木质素含量比对照降低了 19 1% .     

胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜 4CL基因，揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况，为胡萝卜 4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索，获得胡萝卜 4CL基因(命名为 Dc4CL);利用ProtParam分析 Dc4CL的理化性质；利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析；使用GSDS2.0、MEME分析 Dc4CL的基因及蛋白结构；利用荧光定量PCR技术对 Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明，胡萝卜基因组中存在12个 4CL基因，分别为 Dc4CL1～ Dc4CL12。 Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1 350～3 363 bp,编码蛋白质长度为449～1 120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92～123.73 ku和5.34～8.82。系统进化分析表明，Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明， Dc4CL基因外显子数目为4～11个，其蛋白序列...     

滇水金凤4CL基因的克隆及表达分析

【目的】4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）作为苯丙烷类代谢途径的关键酶之一,对花青素合成起着重要作用。探究滇水金凤4CL基因（命名为Iu4CL）对滇水金凤花色调控的分子机理,为其花色调控及花色育种提供参考依据。【方法】以滇水金凤为材料,采用RT-PCR技术分离克隆Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4基因,并对其生物信息学进行分析;通过qRT-PCR技术对4CL基因在4种不同花色（白色、粉色、红色和深红色）及其4个不同花发育时期（花苞期S1、始花期S2、盛花期S3和谢花期S4）中的表达情况进行分析。【结果】Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4的cDNA全长分别为1 620、1 653、1 698、1 638 bp,分别编码539、550、565、545个氨基酸;其中Iu4CL1和Iu4CL2分别含有2个和4个内含子,Iu4CL3和Iu4CL4没有内含子。生物信息学分析表明,Iu4CL1、Iu4CL2和Iu4CL4为稳定蛋白,Iu4CL3为不稳定蛋白;4个基因均为无信号肽疏水性蛋白;Iu4CL2有3个跨膜结构,其余3个基因均不存在跨膜结构;Iu4CL基因...     

GRP1.8-反义pt4CL1基因对巨尾桉 木质素含量的影响

桉树是桃金娘科桉树属(Eucalyptus）植物的统称,是制浆造纸的主要原料之一,但是桉树中含有大量木 质素,木质素的存在会严重影响纸浆的质量。4-香豆酸颐辅酶A 连接酶(4CL）是木质素单体生物合成的关键酶之一, 抑制4CL 基因的表达,可以有效降低植物中木质素的含量。通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将形成层定位启动 子GRP1.8 融合的杨树反义4-香豆酸:辅酶A 连接酶基因导入巨尾桉,经卡那霉素筛选和PCR 鉴定,获得9 株转基 因阳性植株。通过4CL 酶活性测定和木质素、纤维素含量的分析,发现转基因组培苗的4CL 酶活性比对照植株下降 了44%,温室转基因幼苗中硫酸木质素含量下降了16%。     

苦荞Ft4CL基因克隆、生物信息学及分子进化分析

与其他作物相比,苦荞中含有较高含量的黄酮类物质-‘芦丁’。4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,EC 6.2.1.12)是植物苯丙烷代谢途径转向黄酮类物质代谢的关键酶之一。本研究利用已知的来源于‘九江苦荞’叶片的Ft4CL1(HQ654088)基因片段为探针序列,从苦荞叶片转录组数据库中序列拼接得到一个苦荞Ft4CL全长基因,命名为Ft4CL(GenBank登录号:KM362863)。生物信息学分析结果表明:该cDNA长度为2 007bp,具有完整的ORF,共1 743bp,编码580个氨基酸,具备4CL所有活性位点。与已公布的部分Ft4CL基因及蒺藜苜蓿(Pb4CL)、甜瓜(Cm4CL)和黄瓜(Cs4CL)基因相似度为100%、73%、73%和72%。遗传聚类结果显示,该基因归类于双子叶植物。研究结果为深入探讨苦荞黄酮代谢途径提供了基础,也为提高苦荞黄酮含量提供了定向靶基因。     

苦荞C4H基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]为了解植物苯丙烷类代谢途径中关键酶——肉桂酸-4-羟基化酶基因结构特征及系统进化,拟克隆苦荞肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因并进行生物信息学分析。[方法 ]本研究通过RT-PCR技术,克隆2个苦荞C4H基因cDNA和DNA序列,并通过生物信息学分析其基因结构及蛋白理化性质,最大似然树法构建系统进化树。[结果]2个基因cDNA序列长度分别为1 812bp和1 476bp,各编码504和491个氨基酸残基。其DNA序列分别为2 774bp和2 364bp,均包含3个外显子和2个内含子,第1个外显子和2个内含子序列长度存在明显差异。蛋白分子量分别为58.002kDa和56.401kDa,等电点分别为9.18和9.09。2个基因编码氨基酸与苦荞肉桂酸-4-羟基化酶同源性分别为99%和86%,故暂且命名为FtC4H1和FtC4H2。FtC4H1和FtC4H2与其他物种直系同源蛋白聚为两类,FtC4H1和FtC4H2与莴苣和丹参同源蛋白亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为88%和84%。[结论]本研究通过对苦荞2个C4H基因的核酸、氨基酸序列、蛋白结构及系统进化树进行分析,为后续苯丙烷代谢途径及荞麦基因挖掘利用提供理论基础。     

青杨4CL基因的克隆及生物信息学分析

4CL是木质素合成途径中的关键酶,对其进行生物信息学分析,为深入研究4CL的作用奠定基础并为进一步改良青杨提供理论支撑。以青杨嫩茎为试材,采用RT-PCR方法克隆青杨4CL基因,使用NCBI、DNAMAN及Ex PASy等一系列在线软件及工具,对青杨4CL基因的编码区、氨基酸序列及蛋白质的结构和功能进行生物信息学分析。克隆了青杨4CL基因,命名为Pc4CL(Gen Bank注册号:KJ490636)。该基因全长1623 bp,开放阅读框为1~1611 bp,编码536个氨基酸,含有4CL的保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG及催化活性残基His-234。Pc4CL与Pt C4CL同源性最高达97.95%。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

苎麻4-香豆酸辅酶A连接酶-1基因的克隆与分析

为了抑制苎麻木质素代谢关键酶基因的表达,克隆苎麻内源木质素代谢关键酶的基因,为通过基因手段降低木质素含量奠定基础.以苎麻为材料,采用PCR方法,以简并引物从苎麻基因组DNA模板中,首次克隆了其木质素代谢关键酶基因4-香豆酸辅酶A连接酶-1基因(4CL-1)的DNA部分序列,长度为983bp;采用RT-PCR的方法,以特异引物,从苎麻茎RNA反转录的cDNA为模板中,首次克隆了苎庥4CL-1cDNA核心序列,长度为110bp;经生物信息学方法分析,得知所获得的基因序列编码一段含37个氨基酸残基的多肽,该多肽与几个酰基合成酶和AMP结合酶的同源性较高,可以推论其编码了AMP形成与结合的保守区域.     

榅桲4CL基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆榅桲果肉(Cydonia oblonga Mill)中4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)基因,研究其序列特征,为该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果肉为试材,基于GenBank报道的近缘物种4CL基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出4CL基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。【结果】榅桲4CL基因其开放阅读框(ORF)序列为1 710 bp,编码570个氨基酸,蛋白分子质量为68.4 kD,与其他物种序列同源性最高达91.99%,进化关系上与水密桃较近;榅桲4CL蛋白为亲水性蛋白,二级结构中以无规卷曲(Random coil)为主,占比达到44.27%。【结论】获得了榅桲4CL基因全长编码区序列,探明了该序列的结构特征。     

黄瓜CsGASA4基因克隆及生物信息学分析

选取霜霉病与棒孢叶斑病两种病害胁迫后,在抗病品种中上调表达、感病品种中下调表达的基因克隆。通过生物信息学分析,初步开展该基因编码蛋白理化性质分析、亲疏水性预测、亚细胞定位预测、蛋白质结构预测。结果表明,该基因编码区全长315 bp,编码104个氨基酸,编码蛋白属于GASA super-family,具有跨膜结构,存在明显信号肽。系统进化树显示与大马士革玫瑰亲缘关系最近,同源性最高。根据其编码蛋白将该基因命名为Cs GASA4,亚细胞定位于分泌系统囊泡中。研究为进一步探究该基因功能及挖掘黄瓜双抗基因奠定基础。     

紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与表达

为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(PerC4H)的全长cDNA序列(GenBank登录号:KM434189).PerC4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸残基,还含有长度为21 bp的5’非编码区(5'UTR)和95 bp的3 '非编码区(3'UTR).系统进化树分析得到PerC4H基因与唇形科植物丹参和黄芩的亲缘性最近.由实时荧光定量PCR分析可知,该基因在紫苏中具有组织表达特异性,根中的表达最高,茎中次之,而叶中最少.一定浓度的赤霉素与茉莉酸甲酯能提高PerC4H的表达量,而脱落酸和黑暗处理能降低PerC4H的表达量.     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .