亚麻CAD基因克隆及序列分析

以亚麻(Linum usitatissimum L.)为材料,研究木质素代谢的关键酶亚麻肉桂醇脱氢酶基因序列.分离了高纯度的RNA,以RNA为模板,用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,编码159个氨基酸残基.此cDNA序列为亚麻CAD基因序列.     

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用.根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cDNA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS.该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸.序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别.     

苎麻NAD7基因的克隆与分析

线粒体中泛醌氧化还原酶的7亚基基因(NAD7)是与植物呼吸代谢和植物细胞质雄性不育相关的重要基因之一。本研究利用NAD7的保守序列设计引物,用RT-PCR方法克隆了苎麻(Boehmeria nivea)NAD7的cDNA片段,其长度为969 bp,编码322个氨基酸。序列比对表明该cDNA序列及预测的蛋白序列与拟南芥、油菜有98%的同源性。聚类分析表明苎麻NAD7基因的进化处在很古老的地位。为深入研究苎麻雄性不育的分子生物学机理提供依据。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

苦荞C4H基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]为了解植物苯丙烷类代谢途径中关键酶——肉桂酸-4-羟基化酶基因结构特征及系统进化,拟克隆苦荞肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因并进行生物信息学分析。[方法 ]本研究通过RT-PCR技术,克隆2个苦荞C4H基因cDNA和DNA序列,并通过生物信息学分析其基因结构及蛋白理化性质,最大似然树法构建系统进化树。[结果]2个基因cDNA序列长度分别为1 812bp和1 476bp,各编码504和491个氨基酸残基。其DNA序列分别为2 774bp和2 364bp,均包含3个外显子和2个内含子,第1个外显子和2个内含子序列长度存在明显差异。蛋白分子量分别为58.002kDa和56.401kDa,等电点分别为9.18和9.09。2个基因编码氨基酸与苦荞肉桂酸-4-羟基化酶同源性分别为99%和86%,故暂且命名为FtC4H1和FtC4H2。FtC4H1和FtC4H2与其他物种直系同源蛋白聚为两类,FtC4H1和FtC4H2与莴苣和丹参同源蛋白亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为88%和84%。[结论]本研究通过对苦荞2个C4H基因的核酸、氨基酸序列、蛋白结构及系统进化树进行分析,为后续苯丙烷代谢途径及荞麦基因挖掘利用提供理论基础。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

美伐他汀产生菌桔青霉表观遗传调控基因RpdA的克隆及生物信息学解析

为从表现遗传调控的角度对美伐他汀产生菌桔青霉进行分子操作和遗传育种,克隆桔青霉表观遗传调控基因组蛋白去乙酰化酶基因RpdA,对多种真菌的组蛋白去乙酰化酶编码基因序列比较分析,设计简并引物,以桔青霉cDNA和DNA为模板,结合3'-race技术,克隆获取RpdA基因的全长序列,并对其蛋白结构进行生物信息学分析.研究发现:RpdA基因长2 072 bp(GenBank登录号:KC417298),含4个外显子和3个内合子,cDNA开放阅读框长为1 092 bp(GenBank登录号:KC417296),编码639个氨基酸,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassI家族结构特征.     

芥蓝Brassica albograbra花青素合成酶基因BaANS的克隆与序列分析

根据NCBI数据库中的已知序列设计简并引物,分别从芥蓝（Brassica albograbra）叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了花青素合成酶基因。基因命名为BaANS,该基因全长1 369 bp,具一个长度为292 bp的内含子,编码区长度为1 077 bp,编码358个氨基酸,序列已提交到NCBI,登录号为GU170203。序列比对结果表明,BaANS与甘蓝、拟南芥、紫罗兰、白菜和芥菜等的ANS有较高的相似性。     

茶树AMP脱氨酶基因的克隆与序列分析

茶树AMP脱氨酶是茶树咖啡碱合成途径的关键酶,它的活性影响着咖啡碱的的合成,但该酶基因的克隆目前还处于空白状态。通过从茶树全器官转录组文库搜寻的序列进行比对,获得1条与其他物种同源性较高的编码AMP脱氨酶基因的EST序列,运用RACE技术扩增获得茶树AMP脱氨酶基因的cDNA全长序列。该基因cDNA全长3 215 bp,其中开放阅读框长2 571 bp,编码856个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号。预测蛋白分子量为97.6 kDa,理论等电点为6.31。序列分析表明它与葡萄的AMP脱氨酶基因的亲缘关系较近。将基因登陆到GenBank上,登录号为AGJ84350.1。     

慈竹4CL基因的克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆慈竹木质素生物合成酶4CL基因,研究其序列特征,为今后利用该基因调控慈竹木质素的生物合成研究奠定基础。【方法】参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。【结果】成功克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1 674 bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在两大4CL氨基酸保守域(SSGTTGMPKGV和GEICIRG),其中前一个氨基酸保守域的第7个氨基酸位点变为M,与常见的L不同,表明慈竹的4CL基因发生了一定变异。系统进化分析表明,该基因(Na4CL)与水稻的Os4CL4和黑麦草的Lp4CL2具有很高的同源性。【结论】克隆了慈竹木质素合成酶4CL基因全长序列,在GenBank上注册为EU327341,可能与慈竹木质素生物合成有关。     

番茄灵,座果灵对大棚番茄保花保果的试验研究

为提高大棚番茄产量,防止大棚番茄落花落果,应用番茄灵(对氯苯氧乙酸)、座果灵(2,4—二氯苯氧乙酸)各30mg/kg,50mg/kg二种浓度,对大棚番茄的花序用喉头喷雾器进行喷雾处理,效果显著,既能增加果实膨大速度,提前8天上市,又可增加产量,特别是对早期产量有很大提高,30mg/kg番茄灵增产效果明显地高于座果灵,而番茄灵、座果灵又明显地高于对照86.2％和55.8％。     

牛ANGPTL4基因结构和功能的生物信息学分析

以牛ANGPTL4基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码蛋白的结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构以及高级结构进行生物信息学分析,并推测与其他物种的生物进化关系。结果表明,牛ANGPTL4蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,定位于细胞外。含有12个α-螺旋,8个β-折叠,30个转角,3个跨膜结构区域。通过分子进化树研究发现牛的ANGPTL4基因在人、小鼠、大鼠、猪、黑猩猩、狗、鸡等物种中,与猪的亲缘关系最近。     

4-(N-叔丁氧羰基)氨甲基-1-(N-叔丁氧羰基)吡咯烷-3-醇的合成

[目的]改进4-(N-叔丁氧羰基)氨甲基-1-(N-叔丁氧羰基)吡咯烷-3-醇的合成工艺。[方法]以4-氰基-1-(N-叔丁氧羰基)吡咯烷-3-酮为原料,经硼氢化钠、漆原钴催化加氢还原、氨基保护"一锅法"制得目标化合物。[结果]改进的工艺采用漆原钴催化加氢代替原来的氢化铝锂还原,总收率由原来的75%提高至88%,结构经1HNMR确证。[结论]该工艺操作安全,适用于工业化生产。     

湖羊肌肉MC4R基因表达水平与肌内脂肪含量的相关性分析

选取了初生、1～6月龄湖羊公羔和12月龄的周岁公羊各5只,采用real-time PCR检测湖羊不同部位肌肉黑素皮质激素受体4基因(MC4R)mRNA表达水平,分析MC4R mRNA表达的发育性变化及其与肌肉肌内脂肪含量的关系。结果发现:湖羊不同肌肉部位MC4R基因表达的发育性变化模式均为先上升后下降。其中3月龄背最长肌、后腿股二头肌和前腿肱二头肌的MC4R mRNA表达水平达到最大,与其余各月龄相比差异显著,而2月龄腰大肌的MC4R mRNA表达水平达到最大,5月龄MC4R mRNA表达水平在湖羊不同部位肌肉间表现有明显差异,但无明显规律,其后各月龄间均无显著差异。结论:湖羊背最长肌、腰大肌和后腿股二头肌MC4R mRNA表达水平与肌内脂肪(IMF)含量呈负相关关系。     

人IL-32-IgG4（Fc）融合蛋白在CHO/DG44细胞中的表达

【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。     

稀土元素铈减轻铅对玉米毒害的机理初探

通过保护性酶活性及脯氨酸、 MDA含量的检测, 电导率测定研究稀土元素铈减轻玉米幼苗抗重金属铅毒害能力的机理. 结果表明, 用适宜浓度Ce(NH4)2(NO3)6浸种后培养的幼苗, 经重金属铅胁迫后, 能有效地降低相对电导率, 维持较高的SOD活性, 提高POD、 CAT活性, 减缓MDA的积累. 同时, 能促进玉米幼苗脯氨酸累积.     

4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶类化合物的合成及除草活性

对甲苯磺酰胺与2,4-二氯嘧啶在氢化钠作敷酸剂,N,N-二甲基乙酰胺作溶剂的条件下反应,合成了2-氯-4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶。2-氯-4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶再与甲醇钠反应,合成了2-甲氧基-4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶。所合成的目标化合物均通过1H-NMR和元素分析确证。生物活性测试结果表明,4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶类化合物有一定的除草活性,2-氯-4-（4-甲基苯磺酰胺基）嘧啶浓度100μg/ml时对油菜根长生长具有较好的抑制效果。     

木尔坦棉花曲叶病毒“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响

【目的】通过分析发现木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）C4开放阅读框（open reading frame,ORF）附近可编码3个不同大小的蛋白,而NCBI数据库登录的CLCuMuV各个分离物编码的C4蛋白大小也不尽相同,本研究试图通过分析该3个假定的“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响,以明确CLCuMuV C4蛋白ORF的确切定位。【方法】根据双生病毒编码蛋白的保守性,在CLCuMuV C4 ORF附近查找到3个大小不等的ORF,分别标记为C4-L（567 nt）、C4-M（546 nt）和C4-S（303 nt）。利用同源重组的方法将该3个ORF分别构建到PVX异源表达载体,通过农杆菌介导的植物接种法,分析PVX介导的3个蛋白在本氏烟表达对本氏烟症状的影响。利用同源重组的方法构建CLCuMuV野生型及C4-L或C4-S缺失突变型的侵染性克隆,同样通过农杆菌介导的植物接种法,分别与其伴随DNA-β分子的侵染性克隆接种本氏烟,分析C4-L或C4-S缺失对CLCuMuV致病性的影响,并利用Southern blot和Western blot分别对接种烟草的病毒基因组的积累量和病毒C4蛋白的表达量进行分析。同时利用Gateway系统载体对C4-L和C4-S蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位进行分析。【结果】PVX异源表达载体接种本氏烟,结果发现PVX-C4-L和PVX-C4-S接种的本氏烟叶片卷曲、叶柄伸长,并且PVX-C4-S症状更重,而PVX-C4-M接种的本氏烟症状较轻或基本无症状,Western blot试验也在PVX-C4-L和PVX-C4-S接种组检测到了C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白对PVX异源病毒的致病性影响最大。侵染性克隆接种本氏烟,结果发现野生型（CLCuMuV）和C4-L突变型（CLCuMuV-ΔL）接种的本氏烟叶片皱缩增生、叶柄和茎秆扭曲,而C4-S突变型（CLCuMuV-ΔS）和对照组（Mock）接种的本氏烟未显示任何症状,并且前两者的植株高度明显矮于后两者,同时Southern blot试验在CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接种的本氏烟中均检测到大量病毒基因组的积累,而Western blot试验也在其中检测到C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白在CLCuMuV诱导寄主产生症状过程中起关键作用。亚细胞定位发现YFP-C4-L主要定位在本氏烟叶片表皮细胞的叶绿体,YFP-C4-S则定位在细胞膜或细胞质周边,并有点状聚集体结构。【结论】C4-S ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染必不可少,而C4-L和C4-M ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染不是必需。     

铁锰改性海泡石的表征及其对锑污染土壤的修复效果

在对天然海泡石进行铁锰改性并表征的基础上，通过盆栽试验，设3个分别添加0.5%、1.0%和2.5%天然海泡石的处理，3个分别添加0.5%、1.0%和2.5%铁锰改性海泡石的处理和1个空白对照(CK)，共7个处理，探究天然海泡石和铁锰改性海泡石对土壤pH、锑(Sb)的形态及Sb在土壤–小白菜中迁移规律的影响。结果表明：海泡石经铁锰改性后呈现孔洞状结构，比表面积增加18.11%,Fe、Mn质量百分比大幅增加，且Fe、Mn以非晶体形式存在；与CK相比，添加天然和铁锰改性海泡石均提高了土壤pH，其中添加2.5%铁锰改性海泡石的影响最大；添加铁锰改性海泡石增加了土壤晶型铁铝结合态Sb和残渣态Sb的百分比，降低土壤非专性吸附态Sb和专性吸附态Sb、无定形铁锰氧化物和非晶型铁铝结合态Sb的百分比，与添加天然海泡石相比，添加铁锰改性海泡石后的土壤非专性吸附态Sb百分比下降了2.48%～43.31%；添加天然和铁锰改性海泡石后，土壤Sb迁移受阻，能显著降低小白菜各部位Sb质量分数和富集系数，根和茎叶Sb的质量分数分别下降6.83%～44.26%、19.51%～59.23%，其中，添加2.5%铁锰改性海泡...     

剑白香猪葡萄糖转运蛋白4 cDNA的克隆及序列分析

为了在基因水平上给动物的营养代谢研究提供基础性资料,为系统研究剑白香猪这一优质猪种提供参考,以剑白香猪肌肉组织中的总RNA为模板,克隆了剑白香猪的GLUT-4cDNA序列,并对其序列进行了分析。结果表明:克隆片段总长为1 616bp,包含一个长1 530bp的开放阅读框(ORF),编码509个氨基酸残基的蛋白;该蛋白的相对分子质量为54.809 4kDa,等电点为6.98,包含30个功能位点,即3个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酰胺化位点、12个N-豆蔻酰化位点、1个糖转运蛋白signature 1位点和1个糖转运蛋白signature 2位点;剑白香猪与牛、兔、小家鼠、人、马、黑猩猩、褐家鼠、非洲爪蟾GLUT-4基因编码序列的同源性分别为91.76%、90.52%、87.91%、90.52%、92.29%、90.46%、87.52%和65.82%,氨基酸序列的同源性分别为94.7%、95.68%、94.11%、95.09%、94.89%、95.28%、94.5%和68.31%。