甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

毛果杨腺苷酸合成酶基因ACS-1的克隆和酶学分析

乙酰辅酶A连接酶(ACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,与4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)有着紧密的进化关系。通过对毛果杨数据库中4CL基因的同源检索,克隆获得了毛果杨基因Prt4CL8的序列(命名ACS-1,Genebank登录号XM_002329288.1)。序列分析表明,ACS-1具有ACS的关键残基以及C端末尾的PTS1序列;而4CL的高度保守结构域box Ⅰ和box Ⅱ在该蛋白中不保守。利用PCR技术克隆序列,构建表达载体pET30a,转化大肠杆菌并表达重组蛋白。对其进行酶学活性分析,结果证明该蛋白不能催化4CL常见底物,而对ACS底物乙酸钠具有明显催化活性:K_m为(0.25±0.02)mmol·L^-1;V_m为(8.63±0.63)mmol·L^-1。结果表明,ACS-1是ACS家族成员,为腺苷酸合成酶超基因家族成员的鉴定与功能分析提供了一定的理论基础。     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析

胡萝卜(Daucus carota L.)在NCBI(美国国家生物信息中心)上总共公布了13个4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)基因,而在芹菜转录数据中发现1个4CL基因,利用该基因序列设计1对克隆引物,成功得到1个新胡萝卜4CL基因,命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp,编码544个氨基酸,位于胡萝卜基因组第2染色体上。进化树分析显示,Dc4CL-1基因聚集在与木质素合成有关的4CLⅠ亚族。实时荧光定量PCR转录表达发现,在胡萝卜根生长发育期间,Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达,而在栽培胡萝卜中低表达。推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素合成有关。     

桃4CL基因家族鉴定及其在果实色泽发育和采后贮藏冷害中的表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL)在类黄酮和木质素等化合物代谢中具有重要作用。本研究基于桃基因组数据库系统鉴定4CL基因家族成员，从基因家族进化树的角度分析桃4CL基因家族的结构与潜在功能，结合转录组数据和qRT-PCR技术分析其在果实发育阶段类黄酮合成及采后冷害木质化调控中的功能。结果表明，基于桃基因组数据库鉴定出21个4CL基因家族成员，分布在8条染色体上；基因家族进化树分析表明，Pp4CL1与Pp4CL2属于第一亚家族，主要参与木质素合成，Pp4CL3-Pp4CL21属于第二亚家族，主要参与类黄酮的合成；启动子顺式元件分析发现其含有大量的非生物胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)等激素响应元件。发育阶段的基因表达结果表明，Pp4CL8和Pp4CL13的表达水平随发育阶段总体呈上升趋势，且在红肉品种中的表达量高于黄肉和白肉品种，猜测其可能参与花青素等类黄酮合成。采后低温贮藏阶段的基因表达结果表明，Pp4CL2可能在果实采后冷害木质化中发挥作用，程序性降温(low temperature conditioning, LTC)处理后Pp4CL8、...     

GRP1.8-反义pt4CL1基因对巨尾桉 木质素含量的影响

桉树是桃金娘科桉树属(Eucalyptus）植物的统称,是制浆造纸的主要原料之一,但是桉树中含有大量木 质素,木质素的存在会严重影响纸浆的质量。4-香豆酸颐辅酶A 连接酶(4CL）是木质素单体生物合成的关键酶之一, 抑制4CL 基因的表达,可以有效降低植物中木质素的含量。通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将形成层定位启动 子GRP1.8 融合的杨树反义4-香豆酸:辅酶A 连接酶基因导入巨尾桉,经卡那霉素筛选和PCR 鉴定,获得9 株转基 因阳性植株。通过4CL 酶活性测定和木质素、纤维素含量的分析,发现转基因组培苗的4CL 酶活性比对照植株下降 了44%,温室转基因幼苗中硫酸木质素含量下降了16%。     

木质素生物合成酶4CL基因的遗传进化分析

【目的】4CL是木质素生物合成途径中的关键合成酶,通过对4CL基因的遗传进化分析,为其研究和利用提供理论依据。【方法】利用生物信息学手段,对4CL基因完整cDNA和编码氨基酸序列进行数据挖掘,利用Mega软件、ExPASy的Prosite数据库、NCBI的Conserved Domains数据库,进行4CL基因核酸和蛋白质水平上的遗传进化分析。【结果】构建了4CL基因的系统发生树,揭示出植物中的4CL基因聚类与植物分类大体一致,主要以基因家族的形式存在,但基因家族中部分基因存在着结构和功能的分化,4CL基因中存在着GC含量偏高和偏低两大类基因。4CL基因编码的氨基酸序列保守区高度相似,但是在单、双子叶两大类植物之间,其氨基酸平均含量存在着较大差异。【结论】在植物的进化过程中,虽然4CL基因较保守,但部分4CL基因发生了分化,体现在基因的结构和功能方面,在4CL基因的研究中必须充分考虑到这种分化。     

慈竹4CL基因的克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆慈竹木质素生物合成酶4CL基因,研究其序列特征,为今后利用该基因调控慈竹木质素的生物合成研究奠定基础。【方法】参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。【结果】成功克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1 674 bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在两大4CL氨基酸保守域(SSGTTGMPKGV和GEICIRG),其中前一个氨基酸保守域的第7个氨基酸位点变为M,与常见的L不同,表明慈竹的4CL基因发生了一定变异。系统进化分析表明,该基因(Na4CL)与水稻的Os4CL4和黑麦草的Lp4CL2具有很高的同源性。【结论】克隆了慈竹木质素合成酶4CL基因全长序列,在GenBank上注册为EU327341,可能与慈竹木质素生物合成有关。     

高粱TCP基因家族全基因组鉴定及表达分析

为了研究高粱TCP(Teosinte branched 1/cycloidea/proliferating cell factors)基因家族在生长发育和逆境胁迫中的作用,利用生物信息学方法对高粱TCP基因家族成员进行鉴定,并对其进行染色体定位、保守结构域、进化树和表达模式分析。结果表明,共鉴定出27个高粱TCP基因,其在9条染色体上呈不均匀分布,并在3、6、9号等染色体上存在明显的基因簇。进化树分析显示,高粱TCP蛋白可被分为ClassⅠ和ClassⅡ2大类,而ClassⅡ类又可分为CYC/TB1和CIN 2个亚类,ClassⅠ包含10个TCP蛋白, CYC/TB1包含3个TCP蛋白,CIN包含14个TCP蛋白。27个高粱TCP蛋白均有非典型的bHLH(Basic-helix-loop-helix)保守区,其中2个有R结构域。表达模式分析表明,大部分高粱TCP基因在种子、胚、雌蕊、早期花序中表达;PEG处理下,高粱根中大部分TCP基因表达量升高,ABA处理嫩枝中个别基因表达量升高,推测上调表达的高粱TCP基因可能在干旱胁迫响应过程中起重要作用。     

茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆得到Cs4CL1基因,该基因长度为1 715 bp,开放阅读框长度1 623 bp,编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示,Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征,即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示,Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类,属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白,该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。     

反义4CL1基因转化烟草调控木质素生物合成

将控制木质素生物合成的关键限速酶 (香豆酸CoA连接酶 ,4CL)基因 4CL1反向插入植物表达载体pBI12 1构建表达载体 ,通过农杆菌叶盘法介导转化烟草 ,获得一批转基因抗性植株 .经PCR检测 ,证明 4CL1基因已成功反义转入到烟草植株中 .通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析 ,发现反义 4CL1基因转化植株的纤维素含量比对照提高了 11 4 % ,而木质素含量比对照降低了 19 1% .     

瓠瓜KNOX基因家族全基因组鉴定及组织表达分析

【目的】 探明瓠瓜KNOX基因家族特征,在瓠瓜全基因组水平上对KNOX基因家族成员进行鉴定和分析,研究其组织表达模式。【方法】利用生物信息学方法,对瓠瓜KNOX家族基因成员进行鉴定、编码蛋白理化性质分析及家族成员结构域和保守基序分析,利用MEGA 5.05软件构建系统进化树,采用实时荧光定量PCR技术,分析KNOX基因在瓠瓜不同组织（根、茎、叶、花、果实）中的表达情况。【结果】鉴定到12个瓠瓜KNOX家族基因,这些基因分布在6条染色体上,且均定位于细胞核。大多数瓠瓜KNOX家族蛋白含有同源异型盒蛋白特有的4种结构域KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN。系统进化分析将瓠瓜KNOX基因分为KNOX Class Ⅰ和KNOX Class Ⅱ 2大类群,2个类群又可进一步分为5个分支,其中Class Ⅰ-C为瓠瓜特有的进化分支。KNOX基因启动子区有多个激素响应元件和植物生长相关元件。组织表达分析发现,瓠瓜KNOX基因具有不同的表达模式,KNOX Class Ⅰ类基因表达具有组织特异性,在根、茎和果实中表达量较高,在其余组织中表达量较低或不表达,其中Lsi04G014450在根和茎中表达量最高,Lsi11G006380在果实中表达量最高;KNOX Class Ⅱ类基因在所有组织中均有较高表达。【结论】瓠瓜KNOX基因家族有12个成员,分布于6条染色体上,在进化关系上可分为5组,具有瓠瓜特有的进化分支,在不同组织中的表达具有特异性。     

银杏4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆与序列分析

根据银杏(Ginkgo biloba L.)转录组中的基因序列设计引物,从银杏中克隆到了4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)的cDNA片段,命名为Gb4CL,GenBank登录号为KU820947。Gb4CL全长1736bp,含有1个1671bp的ORF,编码557个氨基酸。核苷酸和蛋白质序列多重比较结果显示,Gb4CL与其他植物的4CL基因的核苷酸与蛋白质序列均高度同源。Gb4CL编码的蛋白质与日本柳杉(Cryptomeria japonica)、白豆杉(Pseudotaxus chienii)、北美云杉(Picea sitchensis)的4CL氨基酸同源性分别为82%、83%、80%。4CL系统进化树显示,Gb4CL与裸子植物亲缘关系最近。该研究通过克隆Gb4CL基因,并进行相关的生物信息学分析,可为掌握银杏木质素生物合成中关键基因的调控机理提供参考。     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

鸭梨幼果石细胞分化期Pb4CL基因表达分析

为揭示梨果实石细胞分化的机理,调控石细胞形成和含量,克隆了鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.‘Yali’)4-香豆酸∶辅酶A连接酶基因Pb4CL片段(Gen Bank登录号:KF177692),该片段长467 bp,经同源性比对,该片段与沙梨、欧洲花楸和枇杷等物种4CL基因高度同源,编码155个氨基酸残基,存在4CL蛋白质高度保守区域,具有腺苷酸合成class I超级结构域。建立了梨Pb4CL基因的荧光实时定量表达检测体系,在石细胞分化期Pb4CL基因相对表达量逐渐升高,后呈下降趋势。     

抗倒伏甘蓝型油菜(Brassica napus L.)木质素含量及木质素合成关键基因的表达

测定了甘蓝型油菜6个抗倒伏材料和5个易倒伏材料薹期和花期植株不同部位的木质素含量,并对木质素合成关键酶基因F5H(阿魏酸-5-羟基化酶)基因、4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)基因、COMT(咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶)基因进行RT-PCR扩增,以分析抗倒伏和易倒伏材料间木质素含量的差异以及上述3个与木质素合成相关的关键酶基因的表达差异。结果显示：薹期根颈和茎部木质素含量,抗倒伏材料比易倒伏材料分别高0.95个百分点和1.90个百分点;开花期根、根颈和茎部木质素含量,抗倒伏材料比易倒伏材料分别高2.53个百分点、1.97个百分点和1.58个百分点;COMT基因在薹期和开花期的根、根颈和茎部的表达量,抗倒伏与易倒伏材料间没有明显差异;F5H基因在薹期根、茎部和开花期根部的表达量,抗倒伏材料明显高于易倒伏材料;4CL基因在薹期和开花期根、根颈的表达量,抗倒伏材料明显高于易倒伏材料;但在薹期和开花期的茎部,抗倒伏材料与易倒伏材料间4CL基因表达量差异不显著。表明,抗倒伏材料薹期和开花期根、根颈和茎部合成的木质素含量较高,F5H和4CL基因可能是与油菜抗倒伏性状相关的关键基因。     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .     

普通烟草Nt4CL基因家族的生物信息学分析

为烟草分子育种提供参考,利用序列相似性比对鉴定烟草中的20个Nt4CL基因,并对其基因结构、蛋白理化性质及保守结构域、亚细胞定位进行分析预测。基于普通烟草栽培品种K326转录组数据,对20个Nt4CL基因在烟叶不同生长发育时期的表达量进行可视化分析。结果表明:烟草中Nt4CL基因数目庞大,但其蛋白结构、理化性质等高度保守,且各个家族成员存在组织特异性表达;选择烟草叶片高表达的Nt4CL基因进行功能研究,可为烟草木质素合成的分子调控研究奠定基础。     

青杨4CL基因的克隆及生物信息学分析

4CL是木质素合成途径中的关键酶,对其进行生物信息学分析,为深入研究4CL的作用奠定基础并为进一步改良青杨提供理论支撑。以青杨嫩茎为试材,采用RT-PCR方法克隆青杨4CL基因,使用NCBI、DNAMAN及Ex PASy等一系列在线软件及工具,对青杨4CL基因的编码区、氨基酸序列及蛋白质的结构和功能进行生物信息学分析。克隆了青杨4CL基因,命名为Pc4CL(Gen Bank注册号:KJ490636)。该基因全长1623 bp,开放阅读框为1~1611 bp,编码536个氨基酸,含有4CL的保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG及催化活性残基His-234。Pc4CL与Pt C4CL同源性最高达97.95%。