重组毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶的酶学性质研究

4-香豆酸: 辅酶A连接酶（4CL）催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0～8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.      

毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测

为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31-4CL1．经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致．对毛白杨4-CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3～0.5,最佳表达时间为2 h．37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性．当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%．以耦联有Ni2+-NTA的琼脂糖为亲和层析填料,金属鳌合亲和柱层析一步纯化获得了电泳纯4CL1蛋白,4CL1蛋白对5种底物的比活性分别为:4-香豆酸3 949.0 pkat/mg,咖啡酸2 214.0 pkat/mg,阿魏酸715.0 pkat/mg,肉桂酸84.9 pkat/mg,而对芥子酸没有生物活性．      

茶树中奎尼酸/莽草酸-羟肉桂酰基转移酶基因的克隆及功能研究

从茶树中分离到1个绿原酸生物合成相关基因,命名为Cs HCT。该基因编码1个430个氨基酸的多肽,推测分子质量约为48.6 ku。蛋白质序列比对表明,Cs HCT含有酰基转移酶的保守域HXXXD和DFGWG,与其他物种HCT的同源性在58%~82%。系统发育分析表明,Cs HCT与咖啡中的HCT同源性最高,连同其他植物HCT形成一个独立的组群。通过大肠杆菌异源表达,纯化获得了Cs HCT蛋白,并进行了催化活性研究。结果表明,重组的Cs HCT能有效催化奎尼酸和莽草酸与香豆酰辅酶A的转酰基反应,分别生成香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸。Cs HCT不能催化奎尼酸和咖啡酰辅酶A生成绿原酸。     

5种酚酸类物质对小麦幼苗的化感作用研究

为了研究5种酚酸类物质对小麦幼苗生长和生理指标的影响,测定了不同质量浓度的阿魏酸、对香豆酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、香草酸5种酚酸类物质处理后小麦幼苗的苗高、根长、CAT活性、POD活性等形态、生理指标,为小麦与药用植物轮作的合理性提供依据。结果表明,小麦幼苗的可溶性糖含量均有所升高,50.00 mg/L对香豆酸和0.01、0.10、1.00 mg/L对羟基苯甲酸处理组分别比空白对照高18.79%、42.60%、42.69%、26.57%,均达显著水平;阿魏酸、对香豆酸和香草酸降低了小麦幼苗的苗高和主根长,对羟基苯甲酸增加了幼苗的主根长,但均不显著;对香豆酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性以及SOD活性均有所降低,而丁香酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性均有所升高,0.01、0.10、10.00、100.00 mg/L丁香酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量分别比对照(蒸馏水)显著增加9.63%、11.22%、11.50%、8.13%。香草酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、SOD活性也有所增加。从研究结果可以看出,阿魏酸、对香豆酸对小麦幼苗有一定的化感抑制作用,丁香酸、对羟基苯甲酸和香草酸有一定的促进作用,但它们的化感指数均不大。     

茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆得到Cs4CL1基因,该基因长度为1 715 bp,开放阅读框长度1 623 bp,编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示,Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征,即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示,Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类,属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白,该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。     

植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展

综述了4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的功能、功能与结构的关系及晶体学方面的研究进展,以期为4CL蛋白质的结构和功能的进一步研究提供依据。     

NaCl处理下茉莉酸甲酯对金叶银杏光合色素、抗氧化性及黄酮代谢的调控作用

以金叶银杏幼苗为试验材料，通过0、50（低盐）、150（高盐）mmol·L^-1 NaCl以及在50、150 mmol·L^-1 NaCl下分别添加500 μmol·L^-1茉莉酸甲酯（MJ） 处理金叶银杏幼苗，研究MJ在NaCl处理下金叶银杏幼苗的生理响应及对黄酮苷元含量的调控作用。结果表明，2个水平盐处理（50、150 mmol·L^-1 NaCl) 及添加MJ处理后叶绿素含量降低，但低水平盐可促进类胡萝卜素的积累；低盐+MJ处理可提高叶绿素b的含量。高盐处理可显著地提高丙二醛（MDA）含量、超氧歧化酶（SOD） 活性；高盐+MJ能够显著地降低MDA含量、提高SOD酶活性，而低盐或低盐+MJ处理上述指标变化不显著。2个水平盐处理下苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）以及肉桂醇脱氢酶（CAD）活性均有所提高，但MJ的添加并没有显著提高4CL和CAD的活性。低浓度盐处理在短期内（5 d）就可显著提高金叶银杏黄酮苷元和总黄酮的含量（比对照提高了133.7%）但低盐+MJ处理对黄酮苷元和总黄酮含量提高程度不大；高盐+MJ处理可在长时间内（10~15 d）显著提高槲皮素(154.5%)和总黄酮的含量(132.1%)。本研究为盐胁迫、茉莉酸及黄酮代谢间的作用机制及银杏黄酮的代谢调控提供一定的理论基础和技术支持。     

桃内果木质素沉积过程中酶活性的变化

以大久保和京玉两个桃品种为试材,对果实发育过程中桃内果皮的木质素含量及其相关酶活性进行了测定。结果表明：在盛花后28d时两品种的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的活性都达到最大值,随后都呈现出总体下降的趋势;过氧化物酶（POD）的活性则在盛花后21d时就达到最大值,随后也呈现出总体降低的趋势;而在整个果实发育过程中,两品种桃内果皮中木质素的含量却逐渐增加。由此推论,当PAL,C4H,4CL,CAD和POD表达到一个相对高的水平,形成足够合成木质素所需的前体物质时,桃内果皮才开始快速积累木质素。     

毛果杨腺苷酸合成酶基因ACS-1的克隆和酶学分析

乙酰辅酶A连接酶(ACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,与4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)有着紧密的进化关系。通过对毛果杨数据库中4CL基因的同源检索,克隆获得了毛果杨基因Prt4CL8的序列(命名ACS-1,Genebank登录号XM_002329288.1)。序列分析表明,ACS-1具有ACS的关键残基以及C端末尾的PTS1序列;而4CL的高度保守结构域box Ⅰ和box Ⅱ在该蛋白中不保守。利用PCR技术克隆序列,构建表达载体pET30a,转化大肠杆菌并表达重组蛋白。对其进行酶学活性分析,结果证明该蛋白不能催化4CL常见底物,而对ACS底物乙酸钠具有明显催化活性:K_m为(0.25±0.02)mmol·L^-1;V_m为(8.63±0.63)mmol·L^-1。结果表明,ACS-1是ACS家族成员,为腺苷酸合成酶超基因家族成员的鉴定与功能分析提供了一定的理论基础。     

桃内果皮木质素沉积过程中酶活性的变化

以大久保和京玉两个桃品种为试材,对果实发育过程中桃内果皮的木质素含量及其相关酶活性进行了测定。结果表明：在盛花后28d时两品种的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的活性都达到最大值,随后都呈现出总体下降的趋势;过氧化物酶（POD）的活性则在盛花后21d时就达到最大值,随后也呈现出总体降低的趋势;而在整个果实发育过程中,两品种桃内果皮中木质素的含量却逐渐增加。由此推论,当PAL,C4H,4CL,CAD和POD表达到一个相对高的水平,形成足够合成木质素所需的前体物质时,桃内果皮才开始快速积累木质素。     

GRP1.8-反义pt4CL1基因对巨尾桉 木质素含量的影响

桉树是桃金娘科桉树属(Eucalyptus）植物的统称,是制浆造纸的主要原料之一,但是桉树中含有大量木 质素,木质素的存在会严重影响纸浆的质量。4-香豆酸颐辅酶A 连接酶(4CL）是木质素单体生物合成的关键酶之一, 抑制4CL 基因的表达,可以有效降低植物中木质素的含量。通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将形成层定位启动 子GRP1.8 融合的杨树反义4-香豆酸:辅酶A 连接酶基因导入巨尾桉,经卡那霉素筛选和PCR 鉴定,获得9 株转基 因阳性植株。通过4CL 酶活性测定和木质素、纤维素含量的分析,发现转基因组培苗的4CL 酶活性比对照植株下降 了44%,温室转基因幼苗中硫酸木质素含量下降了16%。     

水杨酸对厚皮甜瓜采后病害及苯丙烷代谢的影响

【目的】探讨采后水杨酸处理对厚皮甜瓜果实采后病害的抑制效果和苯丙烷代谢的增强作用。【方法】以‘玉金香’厚皮甜瓜为试材,用4 mmol•L-1水杨酸采后常温浸泡10 min,测定处理对粉红单端孢（Trichothecium roseum）损伤接种果实病斑直径和自然发病率的抑制,以及对果实苯丙烷代谢关键酶活性和产物积累的影响。【结果】水杨酸处理不仅明显降低了果实损伤接种T. roseum的病斑直径,而且还显著减轻了常温贮藏期间果实的自然发病率。水杨酸处理明显提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂酸羟化酶（C4H）的活性,处理后6 d,其C4H和4CL活性分别比对照高1.0和2.8倍,10 d时PAL活性为对照的1.6倍。此外,处理还显著提高了果实的总酚以及木质素含量,处理后4 d和10 d果实木质素和总酚含量分别高出对照30.6%和30.0%,但处理对类黄酮含量影响不大。【结论】采后水杨酸处理能够通过诱导厚皮甜瓜的苯丙烷代谢增强果实对采后病害的抗性。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

氮肥和多效唑对小麦茎秆木质素合成的影响及其与抗倒伏性的关系

 【目的】明确氮肥和多效唑对小麦茎秆木质素含量的影响,探讨氮肥和多效唑调节茎秆抗倒伏能力的机制。【方法】以小麦品种烟农21和藁城8901为材料,通过田间试验和室内分析,研究氮肥和多效唑对小麦不同时期茎秆抗折力、抗倒伏指数、木质素含量的影响以及木质素合成相关酶的活性变化。【结果】同品种条件下,与低施氮（225 kg•hm-2）处理相比,高施氮（300 kg•hm-2）处理降低了茎秆苯丙氨酸转氨酶（PAL）、酪氨酸解氨酶（TAL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）和4-香豆酸:CoA连接酶（4CL）的活性,茎秆木质素含量、抗折力和抗倒伏指数降低。而喷施多效唑显著提高茎秆PAL、TAL和CAD的活性,木质素含量、茎秆抗折力和抗倒伏指数提高,倒伏面积和倒伏程度降低。相关分析表明,茎秆抗倒伏指数与木质素含量呈显著正相关（r=0.61,P＜0.05）;木质素含量与PAL、TAL和CAD酶活性呈显著正相关,与4CL酶活性相关不显著。【结论】高施氮量处理降低了茎秆木质素合成相关酶的活性和木质素含量,茎秆抗倒伏能力降低。而施用多效唑显著提高茎秆木质素合成相关酶的活性和木质素含量,进而增强了茎秆抗倒伏能力。     

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80 ℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。      

紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶基因的克隆和结构分析

该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐(Amorpha fruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)的cDNA全长序列,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程.所获得的全长4CLA cDNA,有1 911个碱基,包含一个完整的阅读框架,编码540个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明4CLA 是典型的4CL蛋白,含有预计的AMP-binding 位点,接触反应区和保守的Cys.     

Analysis of the Lignin Contents and Related Enzymes Activities in Seed Coat Between Black-Seeded and Yellow-Seeded Rapes (Brassica napus L.)

One pair of near isonegic yellow/black seeded rape (Brassica napus L) were used as experimental materials to study the changes of lignin contents and enzymes activities of 4-coumarate: CoA ligase (4CL), Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) and ferulate 5-hydroxylase (F5H) in seedcoats during the stage of seed development. The variation analysis showed that the changes of lignin contents and enzyme activities of 4CL, CAD and F5H in seed coat had significant differences between black- and yellow-seeded rapes, and also between different development stages. The correlation analysis demonstrated that the lignin contents were positively correlative to the activities of all three enzymes investigated in the study, and the interactions between them in the seed coat of the two lines. For yellow-seeded rape, the correlation coefficient (0.7262018) of lignin content and the interaction between 4CL and F5H was significant, the lignin contents were highly positively correlative to the activities of CAD and F5H, the interaction between 4CL and CAD, and the interaction between CAD and F5H. For the black-seeded rape, only the lignin content was highly positively correlative to the activity of F5H (the correlation coefficient was 0.772949), the other correlation coefficients, i. e. lignin contents to 4CL, CAD activities, the interactions between the three enzymes were not significant although all the correlation coefficients were above 0.5000. The results suggested that 4CL, CAD and F5H regulated the biosynthesis of lignin in seedcoat of rapes,leading to the lignin contents in the seedcoats of the yellow-seeded rape much lower than that of the black-seeded line,and affecting the thickness of the developing seedcoats in rapes. Therefore, it was likely to change the seedcoat ratio by overexpressing or suppressing the activities of one of the enzymes, both of them or all of them.     

Shade stress decreases stem strength of soybean through restraining lignin biosynthesis

Lodging is the most important constraint for soybean growth at seedling stage in maize-soybean relay strip intercropping system. In the field experiments, three soybean cultivars Nandou 032-4 (shade susceptible cultivar; B1), Jiuyuehuang (moderately shade tolerant cultivar; B2), and Nandou 12 (shade tolerant cultivar; B3) were used to evaluate the relationship between stem stress and lignin metabolism in the stem of soybean. Results showed that the intercropped soybean was in variable light condition throughout the day time and co-growth stage with maize. The xylem area and cross section ratio played a main role to form the stem stress. The B3 both in intercropping and monocropping expressed a high stem stress with higher xylem area, lignin content, and activity of enzymes (phenylalanine ammonia-lyase (PAL), 4-coumarate: CoA ligase (4CL), cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), and peroxidase (POD)) than those of B1 and B2. Among the soybean cultivars and planting pattern, lignin content was positively correlated with stem stress. However, a negative correlation was found between lignin content and actual rate of lodging. In conclusion, the shade tolerant soybean cultivar had larger xylem area, higher lignin content and activities of CAD, 4CL, PAL, and POD than other soybean cultivars in intercropping. The lodging in maize-soybean intercropping can be minimized by planting shade tolerant and lodging resistant cultivar of soybean. The lignin content in stem could be a useful indicator for the evaluation of lodging resistance of soybean in intercropping and activities of enzymes were the key factors that influence the lignin biosynthesis.     

Effects of UV-B treatment on controlling lignification and quality of bamboo (Phyllostachys prominens) shoots without sheaths during cold storage

For evaluating the effects of UV-B treatment on lignification and quality of bamboo(Phyllostachys prominens) shoots during postharvest, fresh bamboo shoots without sheaths were irradiated with UV-B at a dose of 8.0 kJ m~(–2) and then stored at(6±1)℃ along with 85–90% relative humidity(RH) for 15 d. The results showed that UV-B treatment apparently slowed down the increase rates of flesh firmness, weight loss, and contents of cellulose and lignin. It also decreased the activities of 4-coumarate CoA ligase(4CL), peroxidase(POD), cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD) and phenylalanine ammonialyase(PAL) and the expression of their encoding genes during cold storage. It was suggested that these effects of UV-B treatment on decreases in these enzymatic activities and the expression of encoding genes might collectively regulate lignin synthesis and accumulation in the flesh of bamboo shoots and consequently benefit in maintaining the edible quality of bamboo shoots during cold storage.