达氟沙星间接竞争ELISA检测方法的建立

将达氟沙星（danofloxacin, DFLX）与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联分别作为免疫原与包被原, 达氟沙星为竞争的半抗原，建立间接竞争ELISA检测方法。试验结果表明,理想的包被抗原浓度为1.25 μg/L, 多抗(DFLX-PcAb)工作浓度为1∶10000,酶标二抗的工作浓度为1∶4000,最适检测范围为0.1～10 ng/L,最低检测限为0.2 ng/L, 批内和批间变异系数分别为3.81%和6.25%。得到回归方程y=0.7975-0.125x（R2=0.989）和标准曲线，从而建立了DFLX的快速检测残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）。     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...     

圆弧青霉菌毒素-青霉酸间接竞争ELISA检测方法的建立

对圆弧青霉菌毒素-青霉酸的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测条件进行优化,建立最佳反应条件下的间接竞争酶联免疫吸附试验。以间接非竞争ELISA基本操作步骤为基础,优化ELISA反应过程中的反应条件,最后建立青霉酸的间接竞争ELISA检测法。经在均一性良好酶标板测试,抗体最适工作浓度为1∶4×103,人工抗原的饱和浓度为3.35μg/mL。试验结果显示,37℃包被2 h,用0.2 g/L BSA封闭液封闭1 h可达到良好的封闭效果;底物的最适反应时间为10 min;以板外竞争反应模式为佳。试验初步建立了青霉酸间接竞争酶联免疫吸附法,为将来ELISA试剂盒的研制奠定基础。     

牛奶中孕酮直接竞争ELISA检测方法的建立

采用直接竞争ELISA方法检测牛奶中孕酮含量.采用碳化二亚胺法,应用辣根过氧化物酶(HRP)标记11-α羟基孕酮琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS),制备孕酮酶标抗原;酶标抗原与牛奶样品中的孕酮共同竞争结合固相包被的孕酮单克隆抗体,建立直接竞争ELISA反应体系.试验结果表明,最佳抗体包被浓度为1∶2 000,最佳酶标抗原工作浓度为1∶16 000,建立的标准曲线为y=-2.4598x+0.999(R2=0.996),牛奶中孕酮检测范围0.12～40 ng/mL,最低检测量为0.12 ng/mL,批内和批间变异系数分别为1.63%和2.49%.成功建立了可用于牛乳中孕酮快速检测的直接竞争ELISA方法.     

SMD残留检测的ELISA方法的建立和初步应用

用戊二醛法将SMD与载体蛋白BSA偶联 ,制备合成抗原SMD BSA作免疫原 ,同法合成包被抗原SMD OVA ,免疫健康家兔获得抗血清。分别用双向琼脂扩散试验和ELISA试验对抗血清进行定性定量测定 ,结果表明所获抗血清特异性针对SMD。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件 ,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度 (50 μg/mL) ,抗血清最佳稀释度 (1∶1 0 0 ) ,酶标抗体的最适工作稀释度 (1∶50 0 ) ,并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在 1 0～ 2 0 0 0 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系。该法检测底限为 63μg/L,低于国际规定残留限量 (1 0 0 μg/kg)和国内规定残留限量 (30 0 μg/kg)的要求。本法同时测定了回收率以及实际样品血清中的SMD的残留含量     

沙拉沙星间接竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为建立动物源性食品中沙拉沙星（SAR）残留的快速检测方法,本试验通过对盐酸沙拉沙星进行分子改造和偶联蛋白合成完全免疫原,免疫小鼠制备SAR单克隆抗体。通过棋盘法确定最佳包被原浓度及一抗稀释度,优化确定最佳反应条件,从而建立间接竞争化学发光酶联免疫（ic-CLEIA）检测方法,并通过灵敏度、精密度、交叉反应率、添加回收试验对该方法进行评价。紫外扫描结果显示,完全免疫原偶联成功;制备的SAR单克隆抗体效价达1：4×10⁶;包被原浓度为0.25 μg/mL,抗体稀释比为1：750 000,4 ℃包被过夜,5%脱脂乳封闭,竞争孵育1 h,酶标二抗稀释比为1：10 000,孵育1 h为ic-CLEIA最佳反应条件;建立的ic-CLEIA方法标准曲线呈线性,线性范围为0.0625~10 ng/mL,R²=0.995,灵敏度IC₅₀为1.45 ng/mL;其平均批内和批间变异系数均<10%;除与二氟沙星的交叉反应率达到98.08%以外,与其他氟喹诺酮类药物的交叉反应率均<8%,与其他非氟喹诺酮类药物均无交叉反应;SAR标准溶液的最低检测限（LOD）为0.32 ng/mL,SAR在鸡肉样品中的LOD为0.46 μg/kg;添加回收率在88.3%~106.7%范围内,其变异系数≤12.2%。结果表明,本研究建立的ic-CLEIA方法检测速度快、灵敏度高,适用于动物源性食品中SAR残留的大量检测,为SAR残留检测提供了新的方法。     

检测牛乳κ-酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较

试验旨在建立一种快速简单检测牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)含量的酶联免疫吸附(ELISA)方法,为解决牛乳蛋白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳κ-CN为包被抗原,以酶标抗体(HRP-IgG)为检测抗体分别建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法,并对两种检测方法进行分析比较。结果表明:对于间接竞争ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为2.5μg/mL,线性范围为62.5~1 000.0ng/mL,变异系数2%,回收率在98.46%~101.68%;对于间接ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为1.56μg/mL,线性范围为0.098~3.125μg/mL,变异系数1%,回收率在99.10%~101.06%。比较两种检测方法,间接竞争ELISA法检测耗时较短,抗体应用量较少,而间接法不需要包被成本较高的目标标准蛋白,相关系数也较高,但其检测体系组成成分较多,且需包被待测样品,较难组成ELISA试剂盒体系,不宜用于现场检测。因此,大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争法,不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单,可更好地用于科研实践。     

Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。     

阿莫西林残留ELISA检测试剂盒质量验证

为了对用于检测牛奶中阿莫西林残留的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒进行质量验证,试验采用不同梯度浓度的方法进行研究。结果表明:阿莫西林标准品浓度在0.5~13.5μg/L范围内具有较好线性关系,50%竞争抑制浓度为2.0μg/L,试剂盒对牛奶中阿莫西林的最低检测限为4.6μg/L。牛奶中分别添加5.0,10.0μg/L的阿莫西林标准品,回收率在72.2%~108.7%之间,批内变异系数小于8.9%,批间变异系数小于11.9%;试剂盒可在37℃条件下保存7 d,可同时检测牛奶中阿莫西林、青霉素、氨苄西林、萘夫西林等药物的残留总量。与仪器方法进行实际样品检测相比,ELISA方法检测结果具有良好的可信度。     

同位素内标-液质联用法测定鸡可食性组织中替米考星残留量

建立了鸡四种可食性组织中替米考星的液相色谱串联质谱内标法。样品经磷酸二氢钾缓冲液和乙腈提取后,C18固相萃取柱净化,以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水为流动相,液相色谱串联质谱法测定,内标法定量。试验结果表明：鸡四种可食性组织中替米考星在1 μg/kg~100 μg/kg的浓度范围内呈线性关系,相关系数r大于0.99;替米考星在鸡四种可食性组织中的检测限为0.5 μg/kg,定量限为1 μg/kg;四种组织中替米考星添加浓度为1 μg/kg~4800 μg/kg时,批间平均回收率为94.6%~100.9%,批内、批间变异系数在1.11%-5.06%范围之间。本方法适用于鸡四种可食性组织中替米考星含量的测定。     

Establishment of Indirect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Tilmicosin in Milk

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting tilmicosin residue in milk was developed and applied to milk samples after the determination of dilution of coating antigen and antibody to timicosin by using checkerboard method,and the optimization of coating condition,reaction time and temperature,and reaction time of enzyme-labled secondary antibody.The results showed that the 50% inhibition concentration (IC₅₀) of the indirect competitive ELISA was 2.1 ng/mL and the limit of detection (LOD) of tilmicosin in milk was 2 μg/L.The recoveries of tilmicosin added in milk at 5,10 and 20 μg/L ranged from 79.2% to 90.1% with the coefficients of variation (CV) not higher than 9.0%.The indirect competitive ELISA would not react with other common macrolide drugs.The sensitivity of indirect competitive ELISA developed in the study complied to the maximum residue limit of tilmicosin set by China,and laid the foundation for the test kit of the rapid detection of tilmicosin in milk.     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的初步建立

为了研究玉米赤霉烯酮的间接竞争ELISA检测方法,试验采用牛血清白蛋白与玉米赤霉烯酮的耦联物(ZEN-BSA)做包被抗原,标准玉米赤霉烯酮(ZEN)做竞争抗原,以制备的可稳定分泌抗ZEN的单克隆抗体为基础,初步建立了ZEN间接竞争ELISA检测方法。结果表明:间接竞争ELISA检测方法线性范围为0.363 2～78.985 2μg/L,最低检测限为0.231 9μg/L;曲线回归方程为y=68.711-25.666x,其中R2=0.987 1,批内平均变异系数为3.10%,批间平均变异系数为6.26%,与相似毒素的交叉反应率均小于0.01%。说明建立的检测方法可以用于ZEN的检测。     

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997)。批内变异系数(CV)为1.07%～5.53%,批间CV值为3.33%～11.92%,确定此方法精确度良好。利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8%～84.32%,小麦面筋67.3%～88.27%,饲料70.3%～85.9%,牛乳83.47%～89.76%,鸡蛋76.2%～87.29%。确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量。     

检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立

利用戊二醛法合成的三聚氰胺—钥孔匙锥蓝蛋白(KLH)为免疫原制得三聚氰胺的多克隆抗体,并在此基础上以重氮法制备的三聚氰胺—牛血清白蛋白为包被抗原建立了检测三聚氰胺的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,理想的包被抗原质量浓度为0.8mg/L,抗三聚氰胺抗血清的稀释倍数为1:400,最适检测范围为0.03-10mg/L,最小检测量为0.01mg/L,批内与批间变异系数分别为1.952%和6.673%,回归方程为y=-0.4239-0.0933。本实验建立的三聚氰胺含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ci-ELISA)方法可用于牛乳样品中三聚氰胺残留的检测。     

克伦特罗单克隆抗体的研制及初步鉴定

为制备克伦特罗(clenbuterol,CL)单克隆抗体,鉴定其特性,采用重氮化法合成克伦特罗-人血清白蛋白(CL-HSA)作为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗体效价和特异性.将细胞反复冻存和传代,考察稳定性.获得细胞株C611...     

磁珠标记的氯霉素直接竞争ELISA方法的建立

采用本实验室制备的氯霉素(CAP)单克隆抗体,以包被抗原1:6 000和酶标CAP单抗1:8 000的稀释比例为工作浓度,建立CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法,cdELISA检测灵敏度达到0.1 μg/L.利用xMag异硫氰酸根末端磁粒标记CAP单克隆抗体制备免疫磁珠,用该免疫磁珠富集样品中的CAP.经过乙酸乙酯抽提免疫磁珠表面吸附的CAP,再通过cdELISA检测,可使CAP的检测灵敏度提高50倍,即达到0.002 μg/L.     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。