牦牛PLIN2基因的克隆及其在卵巢不同发情阶段的表达

试验旨在研究牦牛PLIN2基因的序列特征和表达特性,并分析其表达与不同发情时期的卵巢的相关性。根据GenBank中已知的普通牛序列,设计克隆引物,经RT-PCR扩增得到牦牛PLIN2基因序列。RT-PCR检测PLIN2基因在各个组织中的表达量,实时荧光定量PCR分析卵巢不同发情时期的表达量。结果表明,牦牛PLIN2基因的编码区长为1 353 bp,共编码450个氨基酸,为无跨膜结构的非分泌蛋白。与GenBank中已知的普通牛序列同源性达到99.4%,表明PLIN2基因在进化过程中相当保守。在牦牛的各个组织中PLIN2分布广泛,但不同组织中的表达有差异,卵巢、乳腺、胃和肾脏中相对较多,而肺脏中几乎没有表达。实时荧光定量PCR结果显示,在卵巢的不同发情时期PLIN2都有表达,且在黄体期的表达量最高,表明PLIN2基因在牦牛发情周期中起着不可忽视的作用。     

牦牛HOXA1基因的时空表达及其对机体调控机制的研究

试验旨在获得牦牛HOXA1基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱和时序表达谱,为进一步研究多脊椎骨形成的原因及其机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆多脊椎骨牦牛HOXA1基因,利用半定量RT-PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛组织中的表达情况,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛不同发育时期各组织中的表达情况。RT-PCR结果表明,多脊椎骨牦牛HOXA1基因序列全长为885 bp,其中开放阅读框（ORF）为870 bp,编码290个氨基酸。同源性分析表明,牦牛与普通牛、野牦牛、人、野猪、马、家鼠、黑猩猩、原鸡和野猪的同源性为75.4%～98.1%。组织表达分析表明,HOXA1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、子宫、输卵管、乳腺、睾丸中均有不同程度的表达;时序表达分析表明,随着年龄的增长HOXA1基因在多数组织中的表达量呈逐渐升高趋势。     

Expression Pattern of HOXA1 Gene and Its Putative Regulating Mechanism of Yak

The aim of study was to obtain the yak HOXA1 gene sequence and related bioinformatics information,and analyze its expression spectrum and temporal expression profiles for providing related information of the formation of multiple vertebrae and its mechanism.RT-PCR technology was applied to clone the yak HOXA1 gene,semi-quantitative RT-PCR technique was used to detect the gene expression level in multiple organisms,and Real-time quantitative PCR technique was used to detect the gene expression level in the organisms in different development periods.The results showed that the obtained HOXA1 gene was 885 bp including the ORF of 870 bp,encoding 290 amino acids.The yak HOXA1 gene shared a homology of 75.4% to 98.1% with ordinary cow,wild yak,human,wild boar,horse,mice,chimpanzees,jungle fowl and wild boar.There were different expression level of HOXA1 gene in heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,muscle,stomach,ovaries,uterus,fallopian tubes,breast and testicular tissue.With the growth of the yak,HOXA1 gene expression level in tissue also increased.     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

骨形态发生蛋白IB型受体(BMPR-IB)基因在蒙古羊卵巢和子宫组织中的表达分析

BMPR-IB基因是发现最早且对绵羊排卵率影响机理已经阐明的多胎主效基因,主要在与繁殖有关的组织和器官中表达,并且对绵羊排卵起重要的调控作用。本研究采用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR)技术的相对定量方法对BMPR-IB基因在不同生理时期蒙古羊的卵巢和子宫组织进行了差异表达的研究。定量结果得到-βActin基因的扩增曲线回归方程为y=-3.358x+35.708,回归系数R2=0.990,BMPR-IB基因的扩增曲线回归方程为y=-2.119x+31.424,回归系数R2=0.992。以非发情期蒙古羊的卵巢组织定量结果为对照计算得到BMPR-IB基因在发情期蒙古羊的卵巢组织中表达量最高,在发情期的子宫组织中表达量最低,在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的2.65倍。     

水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

Cloning of Buffalo AQP9 Gene and Analysing its Expression in the Buffalo Tissues

Cloning buffalo AQP9 gene and analyzing its expression in buffalo tissues.A pair of primers was designed according to the released bovine AQP9 sequences in GenBank,which was used to clone buffalo AQP9 gene.The AQP9 gene was amplified by RT-PCR,whose nucleotide sequence and protein structure were analyzed by bioinformatics methods.The expression of AQP9 in buffalo tissues was assayed by Real-time quantitative PCR.The expression of AQP9 gene in buffalo ovary and testis tissue was detected by immunohistochemical staining method.The results showed that the cloned ORF length of buffalo AQP9 gene was 888 bp,which coded 295 amino acids.The results of multiple sequence comparison showed that the nucleotide sequence of buffalo AQP9 shared 99%,90%,97% and 88% homologeous compared with that of Bos taurus,Sus scrofa,Ovis ariessis and Homo sapiens,respectively,while shared 99%,86%,97%,83% homologeous for amino acids,respectively.Phylogenetic tree analysis indicated that AQP9 gene was highly conservative in the evolutionary process.Real-time quantitative PCR results showed that AQP9 gene expressed in buffalo liver,lung,brain,skin,testis and ovary tissues with different levels,had the most abundant expression in liver,followed by in skin and testis,less observed in lung and ovary.The results of immunohistochemical staining showed that the expression of AQP9 protein varied with the development of buffalo ovarian tissue,and gradually enhanced with follicle development.In testicular tissue,AQP9 protein expressed in spermatocyte and leydig cells of developmental stage testis.These results indicated that we had successfully cloned buffalo AQP9 gene sequences.The expression and its function of AQP9 in buffalo ovaries and testes might play an important role in follicle development and spermatogenesis.     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P<0.05;P<0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P<0.05;P<0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

牦牛跨膜附睾蛋白1基因的克隆及其在卵丘卵母细胞复合体中的表达分析

试验旨在分析牦牛跨膜附睾蛋白1（transmembrane epididymal protein 1，TEDDM1）基因的分子特征及其在卵泡发育中的时序表达特性。研究分别收集发情期牦牛大卵泡（φ≥8 mm）、中卵泡（φ=5~7 mm）和小卵泡（φ≤3 mm）中的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）；提取总RNA并反转录，对TEDDM1基因CDS区全序列进行克隆测序，用生物信息学软件分析其编码蛋白分子特征；以牛GAPDH基因为内参，采用实时荧光定量PCR技术分析TEDDM1基因在卵泡发育不同时期的表达水平。结果表明，牦牛TEDDM1基因CDS区全长903 bp，共编码300个氨基酸，与野牦牛、牛、野牛、绵羊和水牛氨基酸序列有极高的相似性，在进化中较为保守；牦牛TEDDM1蛋白为非分泌型不稳定疏水蛋白，共存在7个螺旋结构，整条肽链7次横跨胞膜，属于典型的G蛋白偶联受体；其潜在的磷酸化位点共21个，其中酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点分别为1、3和17个，仅存在1个N-糖基化位点，无O-糖基化位点；存在未知功能结构域蛋白家族（domains of unknow function protein families，DUFs）716结构域，且该结构域涵盖多个跨膜区域；实时荧光定量PCR检测结果发现，中卵泡中TEDDM1基因表达水平显著高于大卵泡和小卵泡（P<0.05），而大卵泡与小卵泡的表达水平差异不显著（P>0.05）。本研究分析了牦牛TEDDM1基因序列及其在牦牛COCs中的表达特性，为进一步揭示该基因在牦牛卵泡发育过程中的调控作用奠定了理论基础。     

水牛PPARG来源环状RNA的鉴定及表达谱分析

为鉴定前期转录组测序分析结果的可靠性，并从中挖掘水牛脂肪沉积潜在环状RNA（circular RNA，circRNA），本研究对10个来源于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）基因的circRNA进行鉴定，根据测序获得的候选circRNA序列信息，设计对向引物进行半定量检测和普通测序以获得真实存在的circRNA，采用实时荧光定量PCR分析其在水牛不同组织和不同部位脂肪组织中的表达谱，半定量检测其在不同物种间的保守性。结果显示，10个候选circRNA中，有5个circRNA可以检测到，测序验证序列与转录组测序分析获得的序列一致，其中2个circRNA可设计出特异性的定量引物，这2个circRNA主要在脂肪组织中表达，且在不同部位脂肪组织中的表达量存在差异；另外3个circRNA在黄牛、牦牛、猪和小鼠的脂肪组织中均有表达，序列长度一致，序列相似度高。以上研究结果提示，转录组测序分析获得的结果可靠，其中有2个circRNA主要在脂肪组织中表达，且物种间保守，可作为研究水牛脂肪沉积的候选基因。     

猪BLM基因N端、C端的克隆及其在不同组织与疾病中的表达分析

为探究猪BLM解旋酶N端、C端的结构功能及其在不同组织和疾病中的相对表达量，本研究采用RT-PCR技术扩增从江香猪BLM基因N端和C端，利用生物信息学软件对克隆所获序列进行分析，同时采用实时荧光定量PCR技术分析BLM基因在猪不同组织及病样中的表达差异。结果显示，试验成功克隆了从江香猪BLM基因N端1 025 bp和C端1 300 bp序列，与GenBank中猪BLM基因序列（登录号：NM_001123084.1）同源性为100%；生物信息学软件预测显示，猪BLM基因序列长度为4 316 bp，包含4 280 bp的开放阅读框，编码一个由1 426个氨基酸组成的多肽链；氨基酸序列比对发现，猪BLM基因氨基酸序列与牛的同源性最高（85%）；结构域预测表明，猪BLM基因有DEXDc、HELICc、RQC和HRDC 4个结构域；系统进化树分析表明，猪BLM基因与牛亲缘关系最近；实时荧光定量PCR结果显示，以心脏为对照，BLM基因在从江香猪各组织中均有表达，其中在睾丸中的相对表达量最高，其次为肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、小肠和大肠，在睾丸和肺脏中的表达量均极显著高于其他组织（P<0.01）；BLM基因在患繁殖与呼吸道综合征猪肺脏、患白血病鸡肝脏和患鸭瘟鸭肝脏中的表达水平均极显著或显著高于正常组织（P<0.01；P<0.05），提示BLM基因的变化可能也会导致动物疾病的发生。本试验结果可为后续畜禽BLM解旋酶原核表达载体的构建及其在重大疾病的发生和预防等研究提供理论依据。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

牦牛Bcl-2、Bax基因克隆及其在生殖轴上的表达分析

试验旨在分析Bcl-2与Bax基因的序列特性，并分析其在母牦牛生殖轴上的表达特点，为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集健康母牦牛与母黄牛下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫组织样品，通过RT-PCR扩增并克隆Bcl-2与Bax基因，并采用生物信息学软件进行序列分析；利用实时荧光定量PCR法检测Bcl-2与Bax基因在牦牛与黄牛不同组织中的表达差异。结果表明，牦牛Bcl-2编码区全长690 bp，编码229个氨基酸；与黄牛Bcl-2基因核苷酸序列同源性最高，为99.86%，其次是山羊、绵羊，同源性分别为98.41%、97.97%；系统进化树表明，牦牛与黄牛亲缘关系最近。牦牛Bax基因编码区全长579 bp，编码192个氨基酸，与黄牛、藏山羊和金堂黑山羊同源性较高，分别为99.83%、99.48%和99.48%，其次是绵羊、马、人，同源性分别为99.14%、95.34%、94.30%；系统进化树表明，牦牛与黄牛亲缘关系最近。Bcl-2和Bax蛋白不存在信号肽，均为酸性不稳定的疏水蛋白。Bcl-2与Bax基因在黄牛及牦牛下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达，其中牦牛卵巢、子宫中Bcl-2基因表达量分别显著和极显著高于黄牛（P<0.05；P<0.01）；牦牛子宫、输卵管中Bax基因表达量显著高于黄牛（P<0.05），牦牛卵巢中Bcl-2/Bax比值极显著高于黄牛（P<0.01），子宫和垂体中显著高于黄牛（P<0.05）。表明Bcl-2与Bax在动物进化中非常保守且在繁殖活动中起重要作用，牦牛卵巢、子宫、输卵管和垂体中的高表达量可能与牦牛处于极端恶劣环境的细胞抗凋亡作用有关。     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

猪DNM2基因克隆、序列分析与组织表达谱研究

本研究旨在对猪发动蛋白2（dynamin-2,DNM2）基因进行克隆和生物信息学分析,并探讨DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。利用RT-PCR结合RACE方法克隆猪DNM2基因cDNA部分序列,与猪表达序列标签进行拼接,获得猪DNM2基因cDNA全长,并对其进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR检测DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。结果表明,猪DNM2基因的开放阅读框（open reading fram,ORF）为2 616 bp,共编码871个氨基酸。DNM2相对分子质量为98 071.30,等电点（pI）为7.04;无信号肽和跨膜结构域,即该蛋白不属于分泌蛋白;DNM2蛋白的二级结构预测发现,构成α-螺旋、β转角、无规则卷曲、延展链的氨基酸数量分别为361、53、335和122个。多重分析结果显示,猪DNM2基因与牛、人、小鼠、大鼠的序列同源性分别为92.6%、91.8%、88.6%和89.3%;进化树分析表明,DNM2基因在物种间具有较高的保守性,不同物种间DNM2基因序列的差异符合物种间的进化性。实时荧光定量PCR结果显示,DNM2基因在脾脏中表达量较高,在乳腺、腿肌、输卵管、卵巢和子宫中表达量均较低。本研究结果为今后深入研究DNM2基因的生物学功能奠定了基础。     

秦川牛Snail2基因扩增、序列特征及表达特性分析

试验旨在扩增秦川牛Snail2基因，构建Snail2基因在其各组织不同发育阶段及脂肪细胞不同分化时期的时空表达规律，为进一步研究Snail2基因在牛脂肪沉积中的功能及调控作用奠定基础。以秦川牛为研究对象，经PCR扩增得到Snail2基因CDS区序列，运用生物信息学软件对其功能结构进行预测，同时采用实时荧光定量PCR检测Snail2基因在新生牛和成年牛各组织及脂肪细胞成脂分化过程中的时空表达谱。结果显示，秦川牛Snail2基因编码序列全长为952 bp。不同物种系统进化树结果表明，牛Snail2蛋白在家牛、水牛、山羊、绵羊中高度保守。磷酸化位点分析发现，存在41个潜在磷酸化位点，其中周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、CDK5、CKⅡ、CKⅠ等多个细胞周期相关激酶参与了Snail2蛋白的磷酸化修饰。蛋白结构域预测发现，牛、人和鼠等8个物种中有8个相似Motif。Snail2蛋白二级结构主要由不规则卷曲构成，二、三级结构预测结果一致。Snail2基因启动子区序列分析发现1个CpG岛及E2F、C/EBPα（CCAAT/enhancer binding proteins alpha）、AP2和Sp1等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。实时荧光定量PCR结果显示，Snail2基因在牛脂肪组织中呈现较高表达水平，且随着脂肪细胞成脂分化和牛生长发育过程均呈现上升趋势，表明Snail2基因在牛脂肪沉积过程中发挥重要作用。研究结果为进一步揭示Snail2基因通过影响脂肪细胞增殖和分化进而影响肉牛脂肪沉积作用机制奠定基础。     

Cloning,Sequence Analysis and Tissue Expression of Porcine DNM2 Gene

This study was aimed to clone porcine dynamin-2(DNM2) gene and analyze the gene structure using bioinformatics methods, the DNM2 gene mRNA level in different tissues was also investigated. We got the DNM2 gene cDNA sequence through stitching the expressed sequence tags (EST) and partial cloned sequence of DNM2 gene using RT-PCR and RACE methods. The mRNA level of porcine DNM2 gene in different tissues were detected with Real-time quantitative PCR. The results showed that DNM2 gene included an 2 616 bp whole length open reading frame (encoding 871 amino acids). DNM2 had a relative molecular mass of 98 071.30 and an isoelectric point (pI) of 7.04,and there was no signal peptide and transmembrane domain, therefore, it did not belong to the secretory protein. The DNM2 second structure contained α-helix (361 amino acids), β-sheet (53 amino acids), random coil (335 amino acids) and extended chain (122 amino acids). The sequence multi-aligned results showed that porcine DNM2 gene shared 92.6%, 91.8%, 88.6% and 89.3% of similar nucleotide sequence with that of cattle, human, mouse and rat, respectively. The phylogenetic analysis showed that DNM2 gene was highly conserved among species. Real-time quantitative PCR results indicated that the expression level of DNM2 gene was relatively higher in spleen while that was relatively lower in breast, leg muscle, fallopian tube, ovary and uterus. This research could provide the basis for the further study of the biological function of DNM2 gene.