ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞因子分泌的影响

为研究镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其联合作用对动物免疫功能的影响,试验以CTLL-2细胞（细胞毒性T淋巴细胞株）为材料,用不同浓度的ZEA （0、5、10、20 μg/mL）、DON （0、0.5、1、2 μg/mL）及联合（空白组、5 μg/mL ZEA、0.5 μg/mL DON、5 μg/mL ZEA＋0.5 μg/mL DON）处理CTLL-2细胞48 h,采用ELISA法检测了细胞内及培养上清液中颗粒酶B （GZMB）、穿孔素（PFP）、干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子的含量。结果显示,ZEA、DON能够降低CTLL-2细胞胞内及培养上清液中PFP、GZMB、IFN-γ的浓度,增加TNF-α浓度,染毒组与对照组相比均有显著或极显著差异（P＜0.05;P＜0.01）,且均呈剂量效应关系;ZEA、DON联合染毒表现为加性效应。结果表明,ZEA、DON及其联合作用可通过影响免疫细胞因子的分泌,降低免疫细胞杀伤活力,间接影响机体体液免疫和细胞免疫的负调节,从而导致动物机体免疫机能下降。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇与玉米赤霉烯酮联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内环境稳态的影响

本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与玉米赤霉烯酮与(ZEA)联合暴露对体外培养鸡脾脏淋巴细胞内环境稳态的影响。分别以0.012 50μg/mL DON+0.006 25μg/mL ZEA、0.050μg/mL DON+0.025μg/mL ZEA、0.2μg/mL DON+0.1μg/mL ZEA、0.8μg/mL DON+0.4μg/mL ZEA对体外培养鸡脾脏淋巴细胞进行联合暴露培养,48 h后测定细胞膜ATP酶(Ca~(2+)-ATP酶、Na~+/K~+-ATP酶)活性以及细胞内pH、Ca~(2+)水平和钙调蛋白(CaM)的mRNA表达水平。同时设不添加毒素的空白对照组。结果表明:添加毒素的各试验组间,细胞内Ca~(2+)水平、CaM mRNA表达水平随毒素浓度的升高而增加,且添加毒素的各试验组均显著或极显著高于空白对照组(P0.05或P0.01)。细胞内pH以及细胞膜Ca~(2+)-ATP酶与Na~+/K~+-ATP酶活性均随毒素浓度的升高而降低,且添加毒素的各试验组均显著或极显著低于空白对照组(P0.05或P0.01)。由此得出,DON、ZEA联合暴露导致体外培养鸡脾脏淋巴细胞内酸化、离子平衡失调等一系列细胞内环境稳态失衡,且呈剂量依赖性。     

ELISpot技术检测猪抗口蹄疫γ干扰素方法的建立

猪口蹄疫免疫防御是控制猪口蹄疫疫情的重要手段,免疫水平指标通常用免疫抗体水平判定。对于其细胞免疫水平检测尚缺乏成熟可靠的技术,本试验利用市售ELISpot试剂盒建立猪口蹄疫特异γ干扰素检测方法,刺激物分别采用疫苗全病毒颗粒（O/Mya98/XJ/2010）、口蹄疫病毒T细胞表位多肽池,以植物血凝素（PHA）为阳性对照,对细胞浓度、刺激物浓度、孵育时间等进行优化。优化条件为：外周血PBMC新鲜提取或冻存细胞成活率90%以上,最佳细胞数为2×10⁵个/孔,最佳反应时间是16 h,病毒粒子146 S含量为100 ng/mL,多肽最佳浓度10 μg/mL,PHA的最佳浓度是20 μg/mL。ELISpot技术检测口蹄疫病毒感染猪γ干扰素方法的建立,为口蹄疫免疫力评价及口蹄疫疫苗免疫效果评估及进一步研究其与疫苗保护力（PD₅₀）的相关性奠定基础。     

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

试验旨在通过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1（MUC-1）、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白（Wnt-7a）、β受体1（IFNAR1）、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化（P>0.05）;浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）,细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组（P<0.05）,引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加（P<0.01）;Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降（P<0.01）;Integrin αvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降（P<0.01）,蛋白相对表达量均显著下降（P<0.05）。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。     

线粒体凋亡途径在玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEA)雄性生殖毒性作用机理,研究ZEA诱导大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)的凋亡途径,试验选取大鼠原代SC为研究材料,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理SC 24 h后,采用实时荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2 mRNA表达水平;用Western blotting法检测Bax、Bcl-2等线粒体凋亡途径相关蛋白表达;同时检测了20μmol/L ZEA联合Caspase-8抑制剂(Z-IETD-FMK)处理对SC凋亡率和线粒体凋亡相关蛋白的影响。结果显示,与对照组相比,20μmol/L ZEA组细胞Bcl-2转录水平显著下降(P<0.05),Bax转录水平显著上升(P<0.05);10、20μmol/L ZEA组Bax/Bcl-2比值及Cyto-CytC、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3表达量极显著上升(P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著下降(P<0.01);与ZEA组相比,ZEA与Z-IETD-FMK联合处理可使ZEA诱导的SC凋亡率极显著下降(P<0.01),tBid/Bid、Bax/Bcl-2、Cyto-CytC、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9蛋白表达显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著上升(P<0.01)。综合试验结果,ZEA能够通过线粒体途径诱导大鼠SC发生凋亡。     

肿节风三清颗粒抗炎和抗哮喘作用

本研究旨在考察肿节风三清颗粒的抗炎和平喘作用。MTT法检测200、400、800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒对RAW264.7细胞活力的影响;用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞建立体外炎症模型,并采用400、800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒处理,ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平;用卵清蛋白（OVA）致敏、激发雌性BALB/c小鼠建立哮喘模型,并采用100、200、300 mg/kg肿节风三清颗粒处理,末次激发24 h后,测定哮喘小鼠气道高反应性（AHR）,取支气管肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞分类计数,ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5和IL-13浓度及血清中OVA-IgE水平。结果显示,200~16 00 μg/mL肿节风三清颗粒对RAW 264.7细胞增殖有显著或极显著促进作用（P<0.05;P<0.01）,与LPS组相比,800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒能够极显著降低TNF-α和IL-6水平（P<0.01）;与哮喘模型组相比,肿节风三清颗粒明显改善了气道高反应性,明显减少了BALF中的炎症细胞数目及IL-4、IL-5和IL-13浓度,极显著降低了血清中OVA-IgE水平（P<0.01）。综上所述,肿节风三清颗粒可通过抑制炎症因子的表达对炎症细胞模型和哮喘小鼠模型起到良好的保护作用。     

Effects of Compound Chinese Herbal Medicinal Polysaccharide Extraction on NF-κB,TNF-α and IL-6 mRNA Expression in Different MHC B-Lβ Ⅱ Genotype of Chickens Lymphocyte

In order to explore the effect of compound Chinese herbal medicines polysaccharides(cCHMPS) on immunomodulatory in different MHC B-Lβ Ⅱ genotype chickens,200 White feather broiler were chosen and PCR-SSCP technique was applied to analyze the polymorphism of MHC B-Lβ Ⅱ gene. The peripheral blood were collected according to the different MHC B-Lβ Ⅱ genotype,and the lymphocytes were isolated from peripheral blood and the cCHMPS were added with a final concentration of 100,75,50 and 0 μg/mL for co-culturing 24 h.Then the expression of NF-κB,TNF-α,IL-6 mRNA in lymphocyte using Real-time PCR method were detected. The results showed that:Compared with the control group,different does of cCHMPS could significantly improve NF-κB,TNF-α,IL-6 mRNA expression levels in chicken with different MHC B-Lβ Ⅱ genotypes (P<0.05), and when the cCHMPS concentration was 50 μg/mL,the NF-κB,TNF-α,IL-6 mRNA expression levels in lymphocyte of AB and AA genotype chicken were significantly higher than that of other groups (P<0.05).The NF-κB,IL-6 mRNA expression levels of AC genotype chicken were significantly higher than the other groups (P<0.05). The TNF-α mRNA expression levels of AC genotype chicken were significantly higher than the other groups when cCHMPS was 100 μg/mL (P<0.05).There results indicated that the cCHMPS could stimulate NF-κB,TNF-α,IL-6 mRNA expression in different MHC B-Lβ Ⅱ genotype chickens,and the optimum immunomodulatory does were different in each MHC B-Lβ Ⅱ genotype chicken.     

Inhibitory Effect of Cyperone on Inflammation of Chicken Alveolar Epithelial Type Ⅱ Cells Induced by APEC

The effects of cyperone on chicken alveolar epithelial type Ⅱ cells infected by APEC-O78 were evaluated through determining TNF-α, IL-10, TLR-4 and TLR-5 in vitro. The results showed that 0.5 μg/mL cyperone significantly decreased the secretion of TNF-α(P<0.05). 1 μg/mL cyperone extremly significantly increased IL-10 secretion(P<0.01). Furthermore, 0.1, 0.5 and 1 μg/mL cyperones all extremly significantly decreased the expression of TLR-4 mRNA(P<0.01), but had no effect on the expression of TLR-5 mRNA(P>0.05). The results indicated that cyperone might inhibit the production of inflammatory cytokines of chicken alveolar epithelial type Ⅱ cells induced by APEC-O78 through blocking TLR-4 signaling pathway.     

Effects of Compound Chinese Herbal Medicinal Polysaccharides on Immune Signal Molecules Expression in Different MHC B-LβⅡ Genotypes Chickens Lymphocyte

This study was aimed to explore the effect of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides (cCHMPS) on immunomodulatory in different MHC B-LβⅡ genotype chickens.MHC B-LβⅡ genotype was analyzed by PCR-SSCP method in 500 chickens.Collected the blood from different MHC B-LβⅡ genotype chickens,isolated peripheral blood lymphocytes,and added cCHMPS with the final concentration of 200,100,75,50,25 and 0 μg/mL cocultured for 24 h.Then the lymphocyte supernatant cAMP,cGMP,Ca²⁺,NO and iNOS content were detected by ELISA.The results showed that cCHMPS could increase cAMP,cGMP,Ca²⁺,NO and iNOS levels in chicken lymphocyte supernatant compared with control group in each MHC B-LβⅡ genotype chickens.And when the concentration of cCHMPS was 50 μg/mL,cAMP,Ca²⁺,NO and iNOS levels of AA and BC genotypes chicken lymphocyte supernatant were higher than that of the same genotype chicken,cGMP level of BC genotype chicken lymphocyte supernatant was higher than that of the same genotype chicken;When cCHMPS concentration was 75 μg/mL,cGMP level of AA genotype chicken lymphocyte supernatant was higher than that of the same genotype chicken;When cCHMPS concentration was 100 μg/mL,cAMP,cGMP,Ca²⁺,NO and iNOS levels of BB genotype chicken lymphocyte of the supernatant were higher than that of the same genotype chicken.cCHMPS could increase cAMP,cGMP,Ca²⁺,NO and iNOS levels in different MHC B-LβⅡ genotypes chickens,and the cCHMPS optimum immunomodulatory doses were different in each MHC B-LβⅡ genotypes chickens.     

黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的累加细胞毒性研究

由于饲料中多种霉菌毒素并存的几率比较高，本研究以仔猪肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，研究黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和呕吐毒素（DON）的叠加细胞毒性。细胞毒性试验选用AFB1、ZEA和DON三种毒素作为响应面Box-Behnke设计的三个因素，以AFB1：10、20、30 μg/L，ZEA：150、300、450 μg/L，DON：500、1000、1500 μg/L作为Box-Behnke设计的三个编码水平。利用响应面设计构建得到17组复合霉菌毒素组合，以其对IPEC-J2细胞活力的影响作为参考指标，得到对细胞损伤程度最高和最低的霉菌毒素添加比例。结果表明：经方程预测后，得到细胞活力最低（霉菌毒素毒性最高）的AFB1、ZEA和DON组合为30、150 μg/L和1500 μg/L，经测定细胞活力为32.32%|得到细胞活力最高（霉菌毒素毒性最低）的AFB1、ZEA和DON组合为10、150 μg/L和600 μg/L，经测定细胞活力为53.01%。该结果为多种霉菌毒素叠加毒性的研究提供了依据。 [关键词] IPEC-J2细胞|黄曲霉毒素B1|玉米赤霉烯酮|呕吐毒素|细胞毒性     

猪肉和鸡肉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素酶联免疫吸附检测方法的建立

为保障动物源性食品安全,本研究建立了分别检测猪肉和鸡肉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和T-2毒素残留的间接竞争酶联免疫吸附法.结果显示,该方法在猪肉和鸡肉样本中DON的检测限分别为34.9和43.5 μg/kg,添加回收率为72.7%~97.1%,变异系数小于8.7%;T-2毒素的检测限分别为33.7和28.7 μg/kg,添加回收率为72.1%~95.0%,变异系数小于11.3%.该方法灵敏度高、准确、简便,适用于猪肉和鸡肉中DON和T-2毒素残留的快速检测.     

The Study on the Cytotoxicity of Palmatine on Goat Endometrial Epithelial Cells in vitro

To explore the cytotoxicity of palmatine in vitro,goat endometrial epithelial cells (EECs) were stimulated by different concentrations of palmatine,then the growth curve of cell was drew by MTT assay which could detect the cell proliferation. The cell growth state was observed by inverted microscope,and Wright-Giemsa staining was used to observe morphological changes of the cells while LDH test was used to check the membrane permeability of EECs. The results showed that when the concentration was 10 to 227 μg/mL,palmatine had a role in promoting proliferation of the EECs,while when the concentration was more than 227 μg/mL,cell proliferation was inhibited,and 50% inhibitory rate of proliferation (IC₅₀) of this drug on EECs was 360 μg/mL.Wright-Giemsa staining results showed that themorphology of the nucleus and cytolymph were not significantly changed when 100 and 200 μg/mL palmatine effected EECs. LDH results showed that when the palmatine concentration was more than 250 μg/mL,LDH content was extremely significantly higher than that of normal cell group(P<0.01).In conclusion,palmatine presented certain toxic effect on EECs with a significant dose-response effect,and the safe dose range of palmatine was less than 250 μg/mL.     

高性能阻隔膜对新制蒸汽压片玉米储存过程防霉效果的研究

本试验利用普通隔膜和高性能阻隔膜材料储存新制蒸汽压片玉米,检测不同保存时间点蒸汽压片玉米的霉变情况,探讨利用高性能阻隔膜储存新制蒸汽压片玉米的可行性。试验以不密封的普通隔膜储存新制蒸汽压片玉米为未密封普通隔膜组,以密封的普通隔膜储存新制蒸汽压片玉米为密封普通隔膜组,以密封的高性能阻隔膜储存新制蒸汽压片玉米为高阻隔膜组。将各组新制蒸汽压片玉米分别在储存0、7、14、21、28、42、56 d后取出,进行感官评价并测定其化学成分含量、脂肪酸值及黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和呕吐毒素(DON)含量。结果表明:1)随着储存时间的延长,未密封普通隔膜组和密封普通隔膜组相继出现霉变现象,高阻隔膜组储存至56 d时尚未出现霉变现象。2)随着储存天数的增加,不同膜处理的蒸汽压片玉米的粗脂肪、可溶性淀粉含量和淀粉糊化度呈降低趋势,粗灰分、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量在储存期间均没有显著变化(P0.05)。3)储存时间对蒸汽压片玉米的脂肪酸值存在极显著的影响(P0.01),高阻隔膜组蒸汽压片玉米的脂肪酸值增长最为缓慢,储存至56 d时其脂肪酸值为10.54 mg/kg。4)在储存期间,蒸汽压片玉米的AFB1、ZEA含量随储存时间延长呈显著上升趋势(P0.05),各组呕吐毒素含量没有显著差异(P0.05);储存至56 d时,未密封普通隔膜组、密封普通隔膜组、高阻隔膜组的AFB1、ZEA和DON含量分别为1.03、0.73、0.01μg/L,181.13、170.49、148.19μg/L和1.23、1.23、1.20μg/m L。由此可见,高性能阻隔膜能够有效抑制霉菌生长,延缓脂肪酸败,使新制蒸汽压片玉米安全储存至56 d。     

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响，本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物，克隆成功后连接至相应的慢病毒载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞，将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平，Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达，ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平，菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示，与对照组相比，干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低（P<0.01），过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高（P<0.01），成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示，布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现，SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少（P<0.01），抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加（P<0.05；P<0.01），促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时，经SUMO-2过表达后，IFN-γ和TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。经SUMO-2干扰后，TNF-α水平显著降低（P<0.05），IFN-γ水平极显著降低（P<0.01），SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述，SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用，可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。     

黄藤素对山羊子宫内膜上皮细胞的体外毒性研究

为了探究黄藤素的体外细胞毒性,采用不同浓度的黄藤素作用山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）后,采用MTT法绘制细胞生长曲线;倒置显微镜下观察细胞生长状态;瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态学变化并通过测定乳酸脱氢酶（LDH）含量检测细胞膜的完整性。结果显示,当黄藤素的浓度为10~227 μg/mL时,黄藤素对EECs有促增殖的作用;当浓度大于227 μg/mL时出现细胞增殖抑制现象,药物对细胞的半数增殖抑制率（IC₅₀）为360 μg/mL;瑞氏-姬姆萨染色结果显示,100、200 μg/mL的黄藤素作用于EECs时均未对其细胞核、细胞浆的形态产生影响;LDH结果显示,药物浓度≥250 μg/mL时细胞LDH的释放量极显著高于正常细胞组（P<0.01）。综上所述,黄藤素作用于山羊EECs后呈现一定的毒性作用,且呈现显著的剂量依赖效应,作用于EECs的安全剂量范围为≤250 μg/mL。     

不同中药对中性粒细胞迁移微血管内皮细胞后溶菌酶释放量的影响

试验旨在探讨脂多糖（LPS）刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMVECs）对跨内皮迁移中性粒细胞（PMNs）溶菌酶释放量的影响及白头翁、黄连、黄柏、秦皮、马齿苋的干预作用。选取0、0.1、1、10、100 μg/mL LPS刺激RIMVECs,采用ELISA法检测12和24 h细胞培养上清液中IL-6水平以确定后续试验所需LPS浓度。建立PMNs跨RIMVECs黏附模型和迁移的Transwell模型,采用细胞计数法、染色法、ELISA方法评价5种中药对LPS刺激RIMVECs后PMNs的黏附情况、迁移率及其溶菌酶释放量的影响。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL LPS作用RIMVECs后24 h时的IL-6水平极显著升高（P<0.001）;与LPS组相比,黄连、白头翁组的PMNs黏附率显著降低（P<0.05）,溶菌酶释放量极显著升高（P<0.001）,秦皮、白头翁组迁移率显著降低（P<0.05）。提示LPS刺激内皮细胞显著抑制了PMNs杀菌酶的释放,中药黄连、白头翁可以显著减轻这种抑制作用,PMNs杀菌酶的释放可能与内皮细胞的功能完整性有关,本试验为进一步筛选有效中药水溶性成分提供了理论依据。     

复合植物精油对脂多糖诱导的断奶仔猪免疫应激的影响

试验旨在研究复合植物精油（OCT）对脂多糖（LPS）诱导的断奶仔猪的免疫应激的影响。试验选取28日龄左右的杜×长×大三元杂交仔猪，随机分成3个处理组：对照组（基础日粮，注射生理盐水），LPS组（基础日粮，注射LPS），OCT组（基础日粮+50 mg/kg OCT，注射LPS）。每组8个重复，每个重复1头猪。于试验第21天注射LPS（100 μg/kg体重）或等体积的生理盐水，注射3 h后前腔静脉采血进行白细胞分类计数；6 h后屠宰，取胸腺、脾脏，-80℃保存，用于测量胸腺、脾脏免疫相关基因白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、核因子（NF-κB）以及转录相关基因转录激活因子3（STAT3）的基因相对表达量。结果表明：①与对照组相比，LPS刺激降低了仔猪血液中白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞数量（P<0.05）；与LPS组相比，日粮中添加OCT提高了白细胞的数量（P<0.05）；②与对照组相比，LPS刺激上调了脾脏、胸腺IL-6、STAT3 mRNA水平（P<0.05），下调了脾脏IL-4、TNF-α及胸腺IL-4、TNF-α、NF-κB mRNA水平（P<0.05）；与LPS组相比，添加OCT下调了脾脏、胸腺IL-6、STAT3 mRNA水平（P<0.05）；上调了胸腺IL-4、IL-10、TNF-α、NF-κB的mRNA水平（P<0.05）。综合上述结果，LPS诱导发生了仔猪免疫应激，OCT在一定程度具有缓解作用。     

鸡PD-1单克隆抗体的制备及生物学功能研究

试验旨在筛选并制备鸡PD-1单克隆抗体,对该单克隆抗体的免疫学特性、结合活性及其对鸡PD-1/PD-L1信号通路激活的阻断作用进行初步研究。运用杂交瘤细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,采用ELISA方法、Ig抗体亚型鉴定试剂盒、Western blotting鉴定抗体的免疫学特性,利用间接免疫荧光技术及流式细胞术检测筛选单抗与鸡PBMCs的结合情况,应用该单抗与IBDV感染7 d后的鸡PBMC细胞作用,利用实时荧光定量PCR技术检测IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况。结果显示,试验获得1株特异、稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为PD-1-D05。该单克隆抗体的亚型属于IgG1,杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为1：2¹¹和1：2.048×10⁵。ELISA和Western blotting检测结果表明,PD-1-D05单抗能与免疫原发生特异性反应,与pET-28a （+）、Rosetta菌株蛋白提取液上清及无关蛋白无交叉反应。间接免疫荧光及流式细胞术检测结果显示,PD-1-D05单克隆抗体能与鸡PBMC特异性结合,且IBDV感染7 d后的PBMC经单抗处理后,IL-2表达量显著升高（P<0.05）,IFN-γ转录水平显著下降（P<0.05）,IL-6表达水平较IBDV攻毒组细胞虽有所下降,但并无统计学差异（P>0.05）。结果表明,试验成功筛选并制备了能够稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的细胞株,所获得的PD-1单克隆抗体具有良好的免疫学特性,该单抗能够特异性识别鸡PD-1分子并与鸡PBMC细胞特异结合,并在一定程度上恢复由于IBDV感染导致的PD-1/PD-L1信号通路激活引发的免疫调节相关细胞因子IL-2、IFN-γ的异常表达。     

猪呼吸道疾病综合征中性粒细胞cAMP-PDE和血浆cAMP、IL-6、TNF-α的变化及中药疗效研究

本试验通过观察呼吸道疾病综合征（PRDC）病猪中性粒细胞（PMN）环磷酸腺苷磷酸二酯酶（cAMP-PDE）活性和血浆cAMP、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的变化及自拟中药汤剂对其的影响与疗效,以期为呼吸道炎症的病理机制与中药防制积累资料。将PRDC病猪随机分组,治疗组灌服由芦根、黄芪、白芍、甘草组成的1 g生药/mL中药,1.5 mL/kg,每天2次,连续给药10 d。停药后取全血检测各组外周血白细胞数量;并分离PMN,HPLC法检测cAMP-PDE活性;ELISA试剂盒测定血浆中cAMP、IL-6、TNF-α的含量。与健康对照组相比,患病组白细胞数量显著升高（P<0.05）,cAMP-PDE活性和血浆TNF-α、IL-6含量均极显著升高（P<0.01）;治疗组TNF-α含量显著升高（P<0.05）。与患病组相比,治疗组的白细胞数量、cAMP-PDE活性和血浆TNF-α含量均显著降低（P<0.05）,IL-6极显著降低（P<0.01）。结果表明PRDC病猪存在外周血白细胞数量、PMN cAMP-PDE活性和血浆IL-6、TNF-α含量升高的异常变化,自拟中药汤剂能改善呼吸道病猪的临床症状,其作用机制与降低白细胞数量,抑制PMN cAMP-PDE活性和降低血浆IL-6、TNF-α含量相关。     

西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的影响

为研究西番莲多糖提取物（Passiflora edulis polysaccharide extract，PEPE）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）感染RAW264.7细胞氧化应激相关因子的影响，本试验探讨了PEPE对氧化应激的调节作用。在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL浓度为1×10⁶个/mL的RAW264.7细胞，分别设细胞对照组、PEPE组（25、50、100、200、400、800和1 600 μg/mL），分别于培养箱培养24和48 h，用MTT法检测细胞活性，筛选PEPE的药物安全浓度范围。试验分为以下6个组：细胞对照组、病毒组、PEPE高（400 μg/mL）、中（200 μg/mL）、低（100 μg/mL）剂量组及维生素C组，其中细胞对照组加入含10% FBS的DMEM培养液，其余组加入PCV2病毒液，孵育2 h后在PEPE组加入对应浓度的PEPE溶液，VC组加入配制好的VC溶液，细胞对照组和病毒组加入含10% FBS的DMEM培养液，培养48 h，同样用MTT法检测细胞活性，以研究PEPE对PCV2感染RAW264.7细胞活性的影响。按照上述6个试验组分组，处理同上，将细胞培养12 h，收集样品用于检测氧化应激相关因子水平。用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测RAW264.7细胞上清中NO含量和细胞内活性氧（ROS）水平、OPT荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，化学发光法检测细胞内黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力。结果显示，PEPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为25~400 μg/mL。PCV2感染RAW264.7细胞后，细胞活性显著降低（P<0.05），而不同浓度PEPE处理组均能提高细胞活性。RAW264.7细胞被PCV2感染后，细胞分泌NO、ROS水平，GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性显著升高（P<0.05），感染细胞GSH含量显著降低（P<0.05）；PEPE作用于PCV2感染的RAW264.7细胞，显著降低感染细胞NO、ROS水平、GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性（P<0.05），100 μg/mL PEPE处理组细胞GSH水平显著升高（P<0.05）。本试验结果表明，PEPE能提高PCV2感染RAW264.7细胞的抗氧化能力，有利于缓解病毒感染所致氧化应激。