不同中药对中性粒细胞迁移微血管内皮细胞后溶菌酶释放量的影响

试验旨在探讨脂多糖(LPS)刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)对跨内皮迁移中性粒细胞(PMNs)溶菌酶释放量的影响及白头翁、黄连、黄柏、秦皮、马齿苋的干预作用。选取0、0.1、1、10、100μg/mL LPS刺激RIMVECs,采用ELISA法检测12和24h细胞培养上清液中IL-6水平以确定后续试验所需LPS浓度。建立PMNs跨RIMVECs黏附模型和迁移的Transwell模型,采用细胞计数法、染色法、ELISA方法评价5种中药对LPS刺激RIMVECs后PMNs的黏附情况、迁移率及其溶菌酶释放量的影响。结果显示,与对照组相比,10μg/mL LPS作用RIMVECs后24h时的IL-6水平极显著升高(P0.001);与LPS组相比,黄连、白头翁组的PMNs黏附率显著降低(P0.05),溶菌酶释放量极显著升高(P0.001),秦皮、白头翁组迁移率显著降低(P0.05)。提示LPS刺激内皮细胞显著抑制了PMNs杀菌酶的释放,中药黄连、白头翁可以显著减轻这种抑制作用,PMNs杀菌酶的释放可能与内皮细胞的功能完整性有关,本试验为进一步筛选有效中药水溶性成分提供了理论依据。     

不同中药对脂多糖刺激RIMVECs后PMNs杀菌酶释放及内源性抗菌肽表达的影响

为比较黄连、白头翁、秦皮、黄柏和马齿苋对脂多糖(LPS)刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)后中性粒细胞(PMNs)释放杀菌酶及内源性抗菌肽(rCRAMP)表达的影响。建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell体系,试验分为LPS对照组、LPS+黄连组、LPS+黄柏组、LPS+白头翁组、LPS+秦皮组和LPS+马齿苋组,运用ELISA和Western Blotting(WB)较全面系统地研究了以上5种中药对LPS刺激RIMVECs后PMNs杀菌酶释放及rCRAMP表达的变化。当LPS刺激RIMVECs后,与LPS对照组相比,LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs弹性蛋白酶(NE)分泌量显著增加;LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs组织蛋白酶(CG)分泌量明显增加,LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs溶菌酶(LYS)分泌量极显著增加,LPS+黄连组rCRAMP相对表达量显著升高。结果表明,黄连和白头翁明显促进LPS刺激RIMVECs后PMNs释放杀菌酶和表达rCRAMP,对机体起保护作用。     

白头翁汤通过抑制TLR4-ERK1/2信号通路缓解LPS诱导的微血管内皮细胞炎性反应

近年来,中药复方抗炎机制的研究不断深入,白头翁汤复方（Pulsatilla decoction,PD）作为经典的清热解毒中药方剂常用于预防和治疗细菌性腹泻。然而其抗炎机制和靶细胞研究仍然不明确,本课题以大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMVECs）为模式细胞,旨在研究白头翁汤对LPS诱导的RIMVECs炎症反应的调控作用。利用LPS刺激RIMVECs,通过荧光定量PCR（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）的方法检测白头翁汤对LPS刺激后RIMVECs的炎性信号通路TLR4-ERK1/2信号通路关键蛋白TLR4、TRAF6、ERK的mRNA及蛋白表达。进一步采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测白头翁汤对LPS刺激后的炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情况。结果表明：白头翁汤可以显著降低LPS诱导的TLR4、TRAF6、ERK的mRNA水平及蛋白表达并降低了LPS诱导的细胞下游炎性因子的分泌。白头翁汤通过抑制TLR4-ERK1/2信号通路缓解LPS所诱导的RIMVECs炎性反应,发挥抗炎作用。     

白头翁汤通过保护微血管内皮细胞的完整性及PMNs迁移杀菌功能的影响

本研究旨在研究白头翁汤(PD)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞损伤的保护作用,从而揭示白头翁汤的药理作用。分别采用水溶性四氮唑(WST~(-1))、乳酸脱氢酶(LDH)、苏木素伊红(HE)和Hoechst33342染色法检测PD和LPS对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)增殖、细胞毒性、细胞连接和细胞核变化的影响;建立中性粒细胞(PMNs)跨RIMVECs迁移的Transwel模型,检测PD对LPS损伤的RIMVECs后PMNs细胞内和细胞外细菌数量的影响。结果显示,LPS(1μg·mL~(-1))致RIMVECs细胞核萎缩、细胞膜损坏,细胞毒性百分比达53.2%;细胞连接破坏导致细胞脱落,脱落率为39.6%。PD(20μg·mL~(-1))对上述损伤有明显的保护作用。在20μg·mL~(-1)PD作用下,LPS诱导的跨内皮迁移的PMNs细胞内外细菌的存活明显减少(P0.01)。结果揭示PD可以有效保护LPS损伤的RIMVECs从而增强PMNs的杀菌能力,为临床治疗动物细菌性疾病用药提供理论依据。     

白头翁散与其他中药联合对大肠杆菌的体外抑菌效果

研究中药白头翁散各组分(白头翁、黄柏、黄连、秦皮)以及其他6种中药对大肠杆菌的体外抑菌效果。用传统水煎法分别提取10种中药的有效成分;采用试管二倍稀释法测定单味中药、两药联合组成药对及自制白头翁散对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,白头翁散各组分均可有效抑制大肠杆菌,其中黄连的MIC为6.250 mg/mL,抑菌效果最佳。单味中药中对大肠杆菌杀菌效果较好的是黄连、秦皮、诃子,MBC均为200.000 mg/mL;药对中白头翁+黄连、大青叶+诃子对大肠杆菌的MIC均为3.125 mg/mL,抑菌效果最佳;白头翁+黄连对大肠杆菌的MBC为12.500 mg/mL,杀菌效果最佳。自制白头翁散对大肠杆菌的MIC为3.125 mg/mL、MBC为100.000 mg/mL。结果提示,白头翁散4种单药相加的抗菌效果优于单药和部分药对。     

复方乌梅汤对禽大肠杆菌病的防治试验

孙荣华等以复方白头翁散（含有白头翁、秦皮、诃子、乌梅、白芍、黄连、大黄等）,潘树桥等以黄芩散,杨富业等以黄连、黄柏、秦皮、白头翁、白芍、茯苓制成汤剂,胡功政等以黄连、黄芩、黄柏、金银花、板蓝根、蒲公英制成丸剂,用来防治禽大肠杆菌病均获得显著疗效.     

白头翁素对RIMEC分泌功能的影响

目的：探讨白头翁素对细菌脂多糖（LPS）诱导的肠黏膜微血管内皮细胞（RIMEC）内皮素（ET-Ⅰ）和一氧化氮（NO）分泌增加的影响.方法：以体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMEC）为试验模型,ET-Ⅰ测定采用酶联免疫技术,NO测定采用还原酶法.结果：白头翁素10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml预孵2 h加入1 μg/ml的LPS刺激12 h后.白头翁素组1 μg/ml ET-Ⅰ分泌显著低于LPS组（P＜0.05）,5 μg/ml、10 μg/ml白头翁素组ET-Ⅰ分泌极显著低于LPS组（P＜0.01）;10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml白头翁素组NO分泌极显著低于LPS组（P＜0.01） 结论：白头翁素可以下调LPS诱导的ET-Ⅰ和NO分泌增加,这可能是白头翁的抗炎机制之一.     

肿节风三清颗粒抗炎和抗哮喘作用

本研究旨在考察肿节风三清颗粒的抗炎和平喘作用。MTT法检测200、400、800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒对RAW264.7细胞活力的影响;用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞建立体外炎症模型,并采用400、800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒处理,ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平;用卵清蛋白（OVA）致敏、激发雌性BALB/c小鼠建立哮喘模型,并采用100、200、300 mg/kg肿节风三清颗粒处理,末次激发24 h后,测定哮喘小鼠气道高反应性（AHR）,取支气管肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞分类计数,ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5和IL-13浓度及血清中OVA-IgE水平。结果显示,200~16 00 μg/mL肿节风三清颗粒对RAW 264.7细胞增殖有显著或极显著促进作用（P<0.05;P<0.01）,与LPS组相比,800、1 600 μg/mL肿节风三清颗粒能够极显著降低TNF-α和IL-6水平（P<0.01）;与哮喘模型组相比,肿节风三清颗粒明显改善了气道高反应性,明显减少了BALF中的炎症细胞数目及IL-4、IL-5和IL-13浓度,极显著降低了血清中OVA-IgE水平（P<0.01）。综上所述,肿节风三清颗粒可通过抑制炎症因子的表达对炎症细胞模型和哮喘小鼠模型起到良好的保护作用。     

小檗碱、绿原酸和黄芩苷对 LPS 损伤大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表达ICAM-1的影响

为研究中药有效成分小檗碱、绿原酸和黄芩苷的抗炎机制,通过体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（Rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs）建立LPS损伤模型,采用免疫细胞化学方法观察了3种中药成分对LPS损伤RIMMVECs表达ICAM-1的影响,并对染色结果进行了图像灰度分析与统计学检验。研究发现,RIMVECs正常状态下低水平表达ICAM-1,用LPS刺激后ICAM—1的表达明显升高,而中药有效成分小檗碱、绿原酸和黄芩苷能够抑制LPS诱导的RIMVECs强阳性表达ICAM-1。结果表明,小檗碱、绿原酸和黄芩苷的抗炎作用与其下调ICAM-1的表达密切相关,为阐明其抗炎机制提供了数据。     

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

试验旨在通过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1（MUC-1）、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白（Wnt-7a）、β受体1（IFNAR1）、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化（P>0.05）;浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）,细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组（P<0.05）,引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加（P<0.01）;Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降（P<0.01）;Integrin αvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降（P<0.01）,蛋白相对表达量均显著下降（P<0.05）。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。     

A comparative study on certain enzymes of the granulocyte from different ruminant species

In the present study the level of enzyme hydrolases (alkaline phosphatase, myeloperoxidase, elastase, arginase, lysozyme and β-galactosidase) of polymorphonuclear cell (PMN) granules in different ruminant species and their release in response to activation was studied. Buffalo PMN alkaline phosphatase activity was higher (P < 0.01) than in PMNs of cattle and goats. Interestingly, myeloperoxidase was higher in cattle PMNs and least in goat PMNs (P < 0.01), a similar pattern was observed in the distribution of enzyme arginase. As far as lysozyme is concerned, its activity was significantly higher (P < 0.01) in PMNs of buffaloes than in the case of cattle and goat PMNs. On activation, these cells released MPO and elastase, in all the species studied, while lysozyme was secreted only in buffalo PMN cells. Activity of certain enzymes related to oxidant defence systems such as glutathione peroxidase and glutathione reductase were higher in cattle and goats compared to that in buffaloes. These observations are likely to have bearing on immunodefense roles played by PMNs and reflected differences among the ruminant species studied.     

黄连组方对大肠杆菌O78的抑菌作用与临床疗效研究

为研究防治鸡大肠杆菌病的新方法,减少抗生素的使用及耐药菌株的产生,试验选取黄连、乌梅、白术等中药制成黄连组方口服液,检测其对大肠杆菌O₇₈的抑制作用与临床疗效。体外试验采用最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）检测口服液抑菌效果;应用流式细胞仪观察口服液对细菌死亡率的影响;利用扫描电镜和透射电镜观察口服液对菌体形态与结构的影响;临床试验检测口服液对鸡大肠杆菌病的治疗效果及免疫器官指数的影响。结果显示,口服液对大肠杆菌的MIC为62.5 mg/mL,MBC为250 mg/mL;流式细胞仪检测可见口服液组大肠杆菌的死亡率为74.1%,空白对照组大肠杆菌死亡率为37.2%;扫描电镜下可见口服液处理组的菌体溢缩、断裂,形成许多残体;透射电镜下可见菌体变形,质壁分离现象。临床疗效显示,黄连组方治愈率为86.67%,而西药组治愈率为63.33%;空白对照组和西药组脾脏指数与模型组差异极显著（P < 0.01）,空白对照组、西药组、黄连组方高剂量组的法氏囊指数极显著高于模型组（P < 0.01）,模型组的胸腺指数显著低于其余各组（P < 0.05）。本试验结果表明,黄连组方可使菌体发生变形、溢缩断裂、质壁分离等变化达到杀菌效果,并可通过提高动物体免疫力来防治雏鸡大肠杆菌病。     

In Vitro Effects of Acellular Milk on the Bactericidal Components of Caprine Polymorphonuclear Neutrophils

The effects of acellular milk on the activity of the microbicidal cationic enzymes of the polymorphonuclear cells of goats were studied in an attempt to explain the phenomenon by which PMN functions fail in mastitis. Assays were undertaken on the myeloperoxidase, lysozyme and elastase activities in a polymorphonuclear cell (PMN) lysate, both in the presence and absence of acellular milk from homologous species. There was a significant decrease (p<0.05) in the activity of lysozyme, myeloperoxidase and elastase in the presence of acellular milk. Superoxide and H₂O₂ production following activation of caprine PMNs by lipopolysaccharide (LPS) was significantly reduced (p<0.05) in the presence of acellular milk. Thus, the microbicidal function of PMNs is significantly impaired in the presence of acellular milk and this may contribute to the development of mastitis in dairy animals.     

六味中药对养殖场供水渠道真菌的抗菌活性研究

为防止养殖场供水渠道长霉,参照M38-A液体微量稀释法测定六味中药对养殖场供水线分离真菌的抗菌活性。结果显示,所选药物对受试菌均有不同程度的抑制作用,黄连、苦参、蛇床子、黄柏、白鲜皮和土荆皮的MIC几何均值分别为2.2、2.8、9.9、19.8、28.1mg/mL和35.4mg/mL。表明,黄柏、白鲜皮和土荆皮抗菌活性较差,蛇床子有一定的抗菌活性,黄连和苦参具有明显的抑菌、杀菌作用。     

中西医药复方制剂炎瘟清对肉鸽鹅口疮的治疗试验

使用中西药复方制剂(由黄连、黄柏等中药和盐酸环丙沙星组成,也称炙瘟清片)时肉鸽鹅口疮进行了药物防治试验,结果表明,治愈率达到93.3%,其疗效稍高于制霉菌素片,明显高于土霉素片和0.05%硫酸铜溶液.     

脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响

试验旨在探讨脂多糖（LPS）对绵羊胚胎附植期Toll样受体4（TLR4）及相关免疫因子表达的影响。以构建好的pcDNA3.1-TLR4过表达载体转染绵羊子宫内膜基质细胞,运用Western blotting技术鉴定细胞转染效果,然后用1 μg/L LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。将经LPS处理的细胞分别培养12、24、48、72 h,采用实时荧光定量PCR技术和Western blotting法检测内膜基质细胞中TLR4 mRNA及蛋白表达量,以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平,并以未经LPS处理的细胞作为对照。结果显示,与对照组相比,LPS促进了免疫因子IL-1β、IL-6的释放量,但随LPS作用时间的延长,细胞中IL-6的表达量逐渐下降,而IL-1β的表达量逐渐升高,使得Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向表达;TLR4 mRNA相对表达量在12、24、72 h均显著高于对照组（P<0.05）,48 h时极显著高于对照组（P<0.01）,且LPS处理后的细胞TLR4蛋白表达量也始终高于对照组。综上所述,pcDNA3.1-TLR4过表达载体成功转入绵羊子宫内膜基质细胞;LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路,并促进了下游因子的表达;子宫蜕膜组织中TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持也起到了重要作用。     

白头翁汤及其主要成分对LPS诱导内皮细胞分泌NO、E-selectin和IL-8的影响

拟探讨白头翁汤及其主要成分对细菌内毒素(LPS)导致的机体炎症等病理损伤的治疗作用.培养内皮细胞至单层融合状态,加入内毒素刺激,3h后加入高、中、低3种浓度的8种药物,继续培养21 h后收集细胞上清液,用ELISA方法测定NO、E-selectin和IL-8的含量.结果显示,白头翁汤高剂量组、白头翁素高剂量组和小檗碱高剂量组的NO含量极显著低于LPS对照组(P＜0.01),白头翁汤中剂量组、白头翁素中剂量组、小檗碱中剂量组和秦皮乙素高剂量组显著低于LPS对照组(P＜0.05);白头翁汤高剂量组和药根碱高剂量组的E-selectin含量极显著低于LPS对照组(P＜0.01),白头翁皂苷B4高剂量组、小檗碱高剂量组和药根碱中剂量组显著低于LPS对照组(P＜0.05);秦皮乙素高剂量组的IL-8含量极显著低于LPS对照组(P＜0.01),白头翁汤高剂量组、秦皮甲素高剂量组和中剂量组、秦皮乙素中剂量组显著低于LPS对照组(P＜0.05).结果提示白头翁汤及其主要成分具有明显的抗细菌内毒素作用,可在由NO、E-selectin和IL-8介导的机体炎症等病理损伤过程中发挥治疗作用.