鹅细小病毒VP3基因与鹅γ干扰素基因在重组禽痘病毒中的共表达

为了构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因与鹅IFNγ基因的重组禽痘病毒,本研究将GPV-VP3基因和鹅IFNγ基因克隆到禽痘病毒转移载体中,构建串联基因的禽痘病毒转移载体pSY-GoIFNγ-VP3,采用脂质体法将其转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑法筛选重组病毒,并进行8轮蚀斑纯化,以及PCR鉴定和间接免疫荧光(IFA)分析。结果表明,所获得的重组病毒rFPV-GoIFNγ-VP3能稳定表达外源基因。本研究为进一步开展GPV重组禽痘病毒疫苗的研制奠定了基础。     

表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究

为研究表达鹅α干扰素(GoIFN-α)基因重组活载体疫苗对抑制病毒增殖活性,本实验从植物血凝素刺激的延边白鹅外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增gIFN-α基因,其大小为576 bp.将其与LacZ表达盒串联克隆于pSY681质粒中构建pSY681-IFN-α-LacZ转移重组质粒.采用脂质体将重组质粒转染于预感染禽痘病毒(FPV) 017株的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝/白斑筛选获得重组禽痘病毒rFPV-IFN-α.采用间接免疫荧光和western blot方法对重组毒鉴定结果显示,GoIFN-α基因在CEF中获得表达,分子质量约为29 ku.表达的CoIFN-α对鹅细小病毒在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用.本研究为进一步开展GoIFN-α基因重组FPV活载体疫苗的体内试验奠定了基础.     

表达鹅副粘病毒F基因的禽痘重组病毒构建

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒(GPMV)主要保护性抗原F基因和LacZ报告基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体转染禽痘病毒(FPV)017株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白筛选获得重组病毒;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中F基因在CEF中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;本研究为进一步的研究重组禽痘病毒的免疫保护性奠定了基础.     

鹅γ-干扰素的原核表达及抗病毒活性研究

本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因与鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒构建

本试验构建了H9亚型禽流感病毒HA基因禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7kb的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,用H9亚型禽流感病毒多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

表达鸡γ-干扰素重组鸡传染性支气管炎病毒的构建及鉴定

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究以IBV疫苗株H120为病毒载体,在其非结构蛋白5a编码区上游插入鸡γ-干扰素(Ch IFN-γ)基因,通过反向遗传操作技术构建重组病毒。经RT-PCR和测序鉴定表明拯救获得重组病毒(r H120-c IFNγ/5a)。生物学特性研究结果表明,r H120-c IFNγ/5a感染鸡胚后能够引起特征性病变,但与其亲本病毒株H120相比,病毒的毒价及其在鸡胚中的复制能力有所下降。将r H120-c IFNγ/5a在鸡胚中连续传代,采用RT-PCR进行检测,结果表明Ch IFN-γ基因在病毒传至第9代时仍保持稳定,至第12代Ch IFN-γ基因出现部分或完全丢失现象。本研究结果为进一步研制以IBV为载体的新型基因重组疫苗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡II型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡II型干扰素(ChIFNγ)基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中,构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY-ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经过8轮蓝斑筛选,得到纯化的能够同时表达鸡II型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγS1。rFPV-ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后,可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体,重组病毒接种鸡的CD4+、CD8+和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡(P<0.05);免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击,rFPV-ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状(1/16),而非免疫对照组则有16只发病(16/16),并有2只出现死亡(2/16),表明rFPV-ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。     

重组鸭干扰素的研发及其在鸭病防治中的应用

根据已发表IFN-γ序列,设计扩增一对IFN的引物,分离鸭脾脏淋巴细胞,提取m RNA,进行RT-PCR扩增,克隆鸭干扰素基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建供体质粒,进而获得重组Bacmid质粒,转染昆虫细胞,得到表达鸭IFN-γ的重组杆状病毒,重组杆状病毒感染昆虫细胞系生产鸭源干扰素;利用VSV-鸭胚成纤维细胞测定重组鸭IFN-γ抗病毒活性,试验验证重组鸭IFN体外抑制鸭源病毒的复制效果和对鸭病毒性疾病的防治作用,并进一步进行临床应用及推广试验,为批量生产安全高效新型抗鸭病毒干扰素奠定坚实基础。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒的构建和表达

本实验采用质脂体转染方法将禽痘病毒转移载体质粒PSY681VP3LacZ转染被禽痘病毒FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞CEF，通过蓝白筛选和6轮蚀斑克隆纯化，获得了稳定的重组病毒。PCR鉴定，重组病毒基因组中含有VP3基因。Dot-ELISA实验证明，重组病毒表达了VP3，并具有抗原性。     

表达猪圆环病毒2型CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒的构建

为了构建共表达猪圆环病毒2型(PCV2)CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒,本研究将CAP基因和猪IL-18基因分别置于pSY538的痘病毒启动子LP2EP2下,然后插入到含有痘苗病毒启动子P11启动的LacZ基因的禽痘病毒转移载体pSY681/lacZ中,获得重组转移质粒pSY681/CAP/IL18。将重组质粒pSY681/CAP/IL18转染入鸡胚成纤维细胞内,使CAP基因、猪IL-18基因和LacZ基因同源重组到禽痘病毒S-FPV-017中,产生重组禽痘病毒,经多次蓝斑克隆筛选纯化后,最终得到共表达CAP蛋白和猪IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-CAP/IL18)。以rFPVCAP/IL18感染CEF,通过RT-PCR检测,CEF细胞中含CAP基因和猪IL-18基因的mRNA,间接免疫荧光试验证实感染rFPV-CAP/IL18的CEF能表达CAP蛋白。重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的CAP和猪IL-18,为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。